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Técnicas de detección y diagnóstico de salmonella spp.

10 febrero 2021

AUTORES

  1. Noemí Pérez Caamaño. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. 
  2. Margarita Elu Escalante. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  3. Alba Berrocal Elu. Diplomado Universitario de Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  4. Violeta Pedragosa González. Grado Universitario en Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  5. Daniel Candala Ramírez. Grado Universitario en Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. 
  6. Guillermo Sánchez Barrón. Grado Universitario en Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. 

 

RESUMEN 

La Salmonelosis (infección por Salmonella) es una de las principales causas de gastroenteritis en España, según la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica se registraron en España entre los años 2014-2017 entre 6800 y 9223 casos de salmonelosis1.

Para evitar y/o minimizar estas elevadas cifras en nuestro país es necesario realizar una detección y diagnóstico precoz de la enfermedad, evitando así la propagación en la comunidad.

Esta bacteria afecta al aparato intestinal, colonizando el intestino de animales y del hombre y se libera mediante las heces. Los humanos se infectan con mayor frecuencia mediante el agua o alimentos contaminados.

El diagnóstico de Salmonelosis se realiza en el Laboratorio de Microbiología, mediante cultivo, técnicas inmunocromatográficas y detección por PCR, siendo estas técnicas realizadas por el Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

 

PALABRAS CLAVE

Salmonella, infección alimentaria, serotipificación, pruebas bioquímicas, PCR Salmonella, inmunocromatografía Salmonella.

 

ABSTRACT

Salmonellosis (Salmonella infection) is one of the main causes of gastroenteritis in Spain, according to the National Epidemiological Surveillance Network between 6,800 and 9,223 cases of salmonellosis were registered in Spain between the years 2014-20171.

To avoid and or minimize these high figures in our country it is necessary to carry out an early detection and diagnosis of the disease, thus avoiding its spread in the community.

This bacterium affects the intestinal system, colonizing the intestines of animals and man and is released through the feces. Humans are most often infected through contaminated food or water.

The diagnosis of Salmonellosis is carried out in the Microbiology Laboratory, through culture, immunochromatographic techniques and detection by PCR, these techniques being carried out by the Superior Technician of the Clinical Diagnosis Laboratory.

 

KEY WORDS 

Salmonella, food infection, serotyping, biochemical tests, Salmonella PCR, Salmonella, immunochromatography.

 

INTRODUCCIÓN

La Salmonelosis es una enfermedad bacteriana caracterizada por un cuadro clínico asociado a infecciones gastrointestinales o sistémicas que pueden ser graves.

Es una enfermedad de declaración obligatoria en España que se produce por la ingesta de agua o productos contaminados con Salmonella, en la ingesta de carnes, aves, huevos o productos derivados del huevo estén crudos o poco cocidos, frutas y verduras sin lavar.

Produce principalmente cuadros gastrointestinales asociados a intoxicaciones alimentarias, aunque también puede producir septicemias y endocarditis si existe diseminación de dicha bacteria por tejidos estériles como LCR y sangre2.

Hay varios tipos de Salmonella, entre los más destacados se encuentran Salmonella entérica y Salmonella bongori que producen intoxicaciones alimentarias. Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son causantes de fiebres tifoideas y paratifoideas respectivamente.

 

OBJETIVO

Definir la bacteria Salmonella y su procesamiento en el laboratorio de Microbiología a partir de técnicas que posean una especificidad y sensibilidad más altas, para poder ofrecer un diagnóstico rápido de la enfermedad, evitando así la propagación comunitaria.

 

METODOLOGÍA 

Se lleva a cabo la realización de una revisión bibliográfica buscando información relevante en bases de datos como Scielo, Elsevier y MedlinePlus. Como buscador de bibliografía se utiliza Google Académico, así como, páginas web de organismos oficiales tales como la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas (SEIMC) y relacionadas con el tema y documentación de organismos oficiales.

 

RESULTADOS

MECANISMO DE TRANSMISIÓN: Los síntomas suelen comenzar en forma de diarrea de 3 a 7 días de duración acompañados de fiebre, náuseas, vómitos, cefaleas y dolor abdominal.

Las diarreas suelen durar hasta unos diez días. La mayoría de las personas sanas se recuperan dentro de unos pocos días sin tratamiento específico, pudiendo ser ingresadas otras por deshidratación.

 

ETIOLOGÍA: Salmonella es un bacilo Gram negativo intracelular que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, patógeno anaeróbico facultativo de flagelos perítricos, catalasa positiva y oxidasa negativa, que fermenta la glucosa y reduce los nitratos.

TOMA DE MUESTRAS: La muestra de elección son las heces que deben recogerse durante la fase aguda de la infección, entre los 3-5 días de la enfermedad.

El coprocultivo es el método de elección para el diagnóstico de infecciones bacterianas intestinales, debe realizarse a partir de heces recién tomadas o de no ser posible se realizará el cultivo de heces refrigeradas en la nevera y recogidas en medio de transporte del tipo Cary-Blair.

Debe recogerse como mínimo 1 gramo de heces en un recipiente limpio y seco, de boca ancha preferiblemente de plástico y bien cerrado, conservar a temperatura ambiente durante las dos primeras horas o en nevera a 4oC dos días como máximo, congelándose pasado este tiempo.

Deben desecharse las muestras de heces mezcladas con orina.

 

EXAMEN MACRO Y MICROSCÓPICO: En primer lugar, se realizará un examen macroscópico observando la consistencia de las heces (sólidas, líquidas o pastosas), así como la presencia de moco y sangre.

El análisis microscópico no suele ser de utilidad porque, aunque pueden aparecer heces sanguinolentas y existir leucocitos están presentes también en otras diarreas invasivas.

 

CULTIVO DE LAS HECES: Las heces líquidas se siembran directamente en los medios de cultivo apropiados para su crecimiento.

Si las heces son sólidas se emulsionará una cantidad del tamaño de un guisante en una solución salina estéril a partir de la cual se inocularán:

  • Un tubo de un medio líquido de enriquecimiento del tipo caldo de F-selenito o caldo de tetrationato.
  • Medios sólidos: Un medio general del tipo Agar sangre, un medio poco selectivo como Agar MacConkey o Agar de eosina azul de metileno (EMB), dos medios selectivos como Agar Hecktoen y Agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD).
  • Todos los medios se incuban en aerobiosis a 37 o C. Los medios sólidos deben examinarse a las 24 y 48 horas y el caldo de enriquecimiento se resiembra a las 24 horas en los medios sólidos anteriormente mencionados3.

Las colonias de Salmonella aparecerán como se indican a continuación:

  • Agar Sangre: Colonias grandes, grisáceas y lisas.
  • Agar MacConkey: Colonias blancas e incoloras.
  • Agar EMB: colonias incoloras y/o transparentes
  • Agar Hektoen: Colonias verdes claro con precipitado negro debido a la producción de Sulfuro de hidrógeno (SH2).
  • XLD: Colonias rojas con centros negros por la producción de (SH2).

Además del cultivo se realizan pruebas bioquímicas con las que se diferencian las bacterias por su actividad metabólica.

La identificación o confirmación de las colonias presuntivas de Salmonella, se lleva a cabo en medios diferenciales usados simultáneamente como el agar hierro triple azúcar (TSI) y el agar hierro lisina (LIA) cuya capacidad es fermentar o no glucosa, sacarosa y lactosa, además de producir o no (SH2). Estos medios se incubarán a 37 o C durante 24 horas.

 

PRUEBAS BIOQUÍMICAS: También se realizarán pruebas bioquímicas complementarias como:

  • Capacidad del organismo de desdoblar la urea formando una molécula de dióxido de carbono y dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa.
  • Capacidad o no de fermentación del dulcitol.
  • Crecimiento o no en caldo cianuro de potasio (KCN).
  • Crecimiento o no en caldo malonato de sodio.
  • Producción o no de indol3.

 

SEROTIPIFICACIÓN: La serotipificación de cepas de Salmonella está basado en el esquema reconocido internacionalmente, de Kauffmann-White que consiste en la caracterización por aglutinación en portaobjetos de los antígenos somáticos (O) y flagelares (H) y rara vez del antígeno capsular Vi.

  • Antígenos somáticos (O): Antígenos de la pared bacteriana cuya naturaleza de un polisacárido, siendo la porción externa un lipopolisacárido (LPS).
  • Antígeno flagelar (H): es la parte filamentosa del flagelo bacteriano; que se compone de subunidades de proteína llamadas flagelinas que permiten al flagelo tomar su estructura filamentosa característica. Hay dos tipos fase 1 y fase 2.
  • Antígeno Vi: Únicamente existe en S. typhi, S. paratyphi y S. dubli.  La presencia de este antígeno hace imposible la aglutinación de suero anti O.

La diversidad de estos antígenos permite la designación de más de 2 500 serotipos de los que sólo 50 son aislados en humanos4,5.

 

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO: Actualmente se detecta la Salmonella a partir de técnicas de biología molecular como es el caso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa a tiempo real (PCR-TR), una técnica basada en la amplificación y detección in vitro del ADN que determina la cantidad de genes sintetizados en cada momento de la reacción.

La PCR-TR se lleva a cabo según el protocolo del kit para detección de Salmonella LightCycler® foodproof, que consiste en realizar 47 ciclos compuestos por tres pasos:

  • desnaturalización (95oC 2 minutos).
  • hibridación (40o C 30 segundos).
  • amplificación (72oC 35 segundos) en el equipo LightCycler 1.5 Instrument (Roche Diagnostic).

La PCR-TR es una valiosa alternativa para determinar Salmonella spp., en alimentos por su especificidad y rapidez, aunque tiene como desventaja su elevado coste.6,7

 

INMUNOCROMATOGRAFÍA: Se somete a técnicas inmunocromatográficas del tipo Salmonella Leti ® (Laboratorios LETI S.L) y siguiendo las recomendaciones del fabricante se tomarán 150 mg de heces sólidas (o 150 ml en caso de heces líquidas) y se introducirán en el vial con diluyente para muestras.

Se agitará la muestra para su homogenización y se dispensará 4 gotas (100 ml) en el pocillo de muestra. Se incubará a temperatura ambiente durante 10 minutos.

El test será positivo cuando aparezca una línea en la posición de control y una línea en la posición de test; test negativo cuando sólo aparece la línea de control e inválido cuando no aparece ninguna línea.

 

CONCLUSIÓN 

El uso de diferentes métodos de identificación de Salmonella spp. presenta una variabilidad en tiempo y resultados obtenidos por cada técnica realizada.

El coprocultivo sigue siendo la técnica de referencia por su bajo coste, aunque haya un mayor tiempo de obtención de resultados, la inmunocromatografía requiere una gran concentración de Salmonella spp para obtener resultados fiables y la PCR es rápida, pero tiene como desventaja su elevado coste.

Por lo tanto, es necesario realizar técnicas complementarias para poder detectar a la mayor brevedad la contaminación de los alimentos evitando así la propagación de la enfermedad a la población.

Establecer también programas de control de limpieza y desinfección además de medidas sanitarias e higiénicas.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Resultados de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Salmonellosis Vigilancia 2014 a 2017. Disponible en:
    https://www.isciii.es/QueHacemos/Servicios/VigilanciaSaludPublicaRENAVE/EnfermedadesTransmisibles/Documents/resultados%20vigilancia/Salmonelosis-RENAVE%202014-2017.pdf
  2. Protocolos de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Protocolo de Vigilancia de Salmonelosis (Salmonella spp. Distinta de S. typhi y S. paratyphi). Disponible en:
    https://www.isciii.es/QueHacemos/Servicios/VigilanciaSaludPublicaRENAVE/EnfermedadesTransmisibles/Documents/PROTOCOLOS/Protocolo%20de%20Vigilancia%20de%20Salmonelosis.pdf
  3. González Pedraza J, Pereira Sanandres N, Soto Varela Z, Hernández Aguirre E, Villarreal Camacho J. Aislamiento microbiológico de Salmonella spp. y herramientas moleculares para su detección. Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/sun/v30n1/v30n1a09.pdf
  4. Sanz JC, Usera MA, Reina J, Cardeñoso L, Vasallo F. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC). Gastroenteritis bacterianas, víricas, parasitarías y tóxico-infecciones alimentarias año 1994. Disponible en:
    https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia7.pdf
  5. Barreto M, Castillo-Ruiz M, Retamal P.Revista chilena de infectología versión impresa ISSN 0716-1018. Rev. chil. infectol. vol.33 no.5 Santiago oct. 2016. Salmonella enterica: una revisión de la trilogía agente, hospedero y ambiente, y su trascendencia en Chile. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-21252018000300012
  6. Echeita MA, Aladueña AM, Díez R, Arroyo M, et al Servicio de Enterobacterias. Servicio de Bacteriología. Centro Nacional de Microbiología Majadahonda Madrid España. Distribución de los serotipos y fagotipos de Salmonella de origen humano aislados en España en 1997-20.Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-distribucion-serotipos-fagotipos-salmonella-origen-13072161
  7. Yánez E, Máttar S, Durango A. Determinación de Salmonella spp. por PCR en tiempo real y método convencional en canales de bovinos y en alimentos de la vía pública de Montería, Córdoba. Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v12n4/v12n4a03.pdf
  8. Liébana-Martos MC, Gutierrez J, Riazzo C, Navarro JM.Sensibilidad de tres test inmunocromatográficos para detección de Campylobacter y Salmonella en heces en comparación con el cultivo. Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada. Disponible en: https://seq.es/seq/0214-3429/27/2/liebana.pdf