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Técnica de detección de malaria por PCR anidada.

8 septiembre 2021

AUTORES

  1. Andrea Espartero González. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  2. Sergio López Ferreruela. Celador. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  3. Yasmina Urcia Juberias. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  4. Ada Bayod García. Enfermera. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  5. Beatriz Jiménez Moraleda. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  6. José María Monteagudo Fontana. Celador. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.

 

RESUMEN

La malaria o paludismo es una enfermedad potencialmente mortal causada por protozoos del género Plasmodium spp, capaz de parasitar la sangre de los individuos mediante inclusiones de las células sanguíneas y que se transmite al ser humano a través de la picadura de la hembra del mosquito Anopheles1, 2.

Para evitar esta parasitación es imprescindible realizar la detección y diagnóstico del helminto a través de pruebas de técnicas hematológicas, de inmunodiagnóstico y de biología molecular que permitan la identificación del patógeno2,3.

El diagnóstico de Plasmodium spp. se realiza en el Laboratorio de Microbiología mediante diversas técnicas entre las que se encuentra su detección mediante PCR anidada (nested-PCR), que será realizada por el Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

 

PALABRAS CLAVE

Plasmodium, biología molecular, PCR anidada, malaria.

 

ABSTRACT

Malaria is a life-threatening disease caused by protozoa of the genus Plasmodium spp, which can parasitize the blood of individuals through blood cell inclusions and is transmitted to humans through the bite of the female Anopheles mosquito.1,2

To avoid this parasite, it is essential to detect and diagnose the helminth through hematological, immunodiagnostic and molecular biology tests that allow the identification of the pathogen. 2,3

The diagnosis of Plasmodium spp is made in the Microbiology Laboratory using various techniques including its detection by nested PCR (nested-PCR), which will be carried out by the Superior Clinical Diagnostic Laboratory Technician.

 

KEY WORDS

Plasmodium, molecular biology, neested PCR, malaria.

 

INTRODUCCIÓN

Según la OMS, la malaria o paludismo es producida por un protozoo del género Plasmodium spp el cual pasa a infectar al ser humano a través de una picadura de la hembra del mosquito Anopheles. Dentro del género Plasmodium spp, podemos encontrar cuatro especies de este parásito que son los culpables de causar, como ya se ha dicho, la malaria o paludismo siendo dos de ellas (P. falciparum y P. vivax) las más peligrosas 1, 2, 3.

Puesto que la malaria es una enfermedad febril aguda, los pacientes infectados por Plasmodium spp suelen presentar los primeros síntomas entre los 10 y 15 días tras la picadura del mosquito. Estos primeros síntomas pueden ser difíciles de reconocer puesto que pueden producir un cuadro leve de fiebre, dolor de cabeza, sudoración y escalofríos; sin embargo, si no se tratan en las primeras 24 horas puede agravarse pudiendo llegar a presentar una afectación multiorgánica. Las principales complicaciones pueden llegar a producir daño cerebral, insuficiencia renal, fiebre biliosa hemoglobinúrica, anemia severa, edema pulmonar, ictericia, daño hepático, hemorragia y síntomas gastrointestinales. Los picos de fiebre por malaria coinciden con la rotura de los hematíes y la liberación de nuevos parásitos al torrente sanguíneo. 1, 2, 6

Hay varios métodos para la identificación de este parásito sanguíneo como puede ser la observación en fresco de un frotis, mediante la técnica de la gota gruesa o por la detección de antígenos parasitarios por inmunocromatografía; sin embargo, en esta revisión vamos a centrarnos en técnicas de biología molecular, concretamente en la PCR anidada o nested-PCR, por ser un método rápido y efectivo que permite identificar la especie y permite su cuantificación 2, 4, 7.

 

OBJETIVO

Determinar la presencia de Plasmodium spp en muestras dentro del laboratorio de Microbiología a partir de una técnica de biología molecular como es la PCR anidada con el fin de ofrecer un diagnóstico rápido, evitando así complicaciones mayores en la salud del paciente.

 

METODOLOGÍA

Esta revisión bibliográfica se ha llevado a cabo recabando aquella información que se ha considerado relevante en distintas bases de datos como son Scielo, Elsevier y Medigraphic. Como buscadores de bibliografía se ha utilizado Google Académico y Pubmed lo que ha ofrecido la posibilidad de consultar contenidos de MEDLINE así como una amplia gama de revistas científicas relacionadas con investigaciones biomédicas.

 

RESULTADOS

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada en el laboratorio para amplificar y replicar secuencias de ADN. Este método usa secuencias cortas de ADN, replicándose de modo que permite estudiar dicha molécula de ADN en el laboratorio. Si bien la PCR es una de las técnicas más utilizadas, lo cierto es que tiene algunas limitaciones como puede ser la dificultad a la hora de cuantificar el producto de la PCR así como el riesgo de provocar una contaminación dentro del laboratorio 5, 8.

Además de la PCR estándar, actualmente se dispone de otras técnicas que permiten mayor especificidad de aplicaciones cuyo fin es suplir las desventajas que hay en una PCR estándar o convencional. Entre esas técnicas se encuentra la PCR anidada, a la que también se denomina nested-PCR o Doble PCR. En esta técnica se realizan dos reacciones PCR acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera PCR. Esta PCR anidada se utiliza principalmente para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es baja o para aumentar la especificidad4,5,6.

Las muestras biológicas de elección para realizar una PCR anidada con el fin de determinar la presencia de Plasmodium spp será sangre venosa puesto que, como se ha dicho anteriormente, esta enfermedad está causada por un parásito sanguíneo que vive en la sangre libremente como inclusiones de las células sanguíneas2,6.

La detección de Plasmodium spp a partir de técnicas de biología molecular como es la reacción en cadena de la polimerasa anidada es una técnica de diagnóstico rápido y se basa, como se ha expuesto anteriormente, en la amplificación y detección de ADN con el fin de determinar la cantidad de genes sintetizados en cada momento de la reacción; sin embargo, debido a las características especiales de la PCR anidada, es verdad que esta lleva precisa el doble de tiempo que una PCR convencional5,8.

El uso de la PCR anidada se basa en un proceso donde la primera PCR se usa para amplificar un fragmento de mayor longitud que servirá como molde de ADN para la segunda PCR, pues contiene la región de interés, y donde la segunda PCR es la encargada de reconocer el producto de interés dentro de la secuencia de ADN. Este proceso permite el aumento de la especificidad y la sensibilidad en la detección puesto que obtenemos un mayor número de copias del rango de interés. Por otro lado, esta técnica también ofrece otras ventajas no sólo frente a otras PCR, sino a otras técnicas de detección de Plasmodium como es la gota gruesa puesto que nos ofrece la posibilidad de detectar parasitemias submicroscópicas4,5.

La PCR anidada es una valiosa alternativa para la detección principalmente de P. falciparum y P. vivax debido a su capacidad para determinar la especie de este parásito; sin embargo, su uso debe ser considerado una herramienta a usar junto con el resto de métodos de diagnóstico existente, sobre todo en casos en que en que haya poca cantidad de muestra2,4.

 

CONCLUSIONES

Debido a que Pasmodium spp es un microorganismo parásito que puede presentar complicaciones muy rápidamente, es conveniente usar todos los métodos diagnósticos para su identificación con el fin de hacerlo a la mayor brevedad posible.

Si bien es cierto que la PCR anidada es una herramienta tremendamente útil para la detección debido a su enorme especificidad y sensibilidad así como la diferenciación de especies cuando hay dificultades morfológicas o en caso de infecciones mixtas, también presenta desventajas como la duplicación de tiempo que requiere así como una mayor probabilidad de contaminación de la muestra; sin embargo, su mayor desventaja radica en que no es una técnica comercializada y no todos los laboratorios están equipadas para llevarla a cabo2,4,6.

Es por ello que técnicas como la gota gruesa coloreada con la tinción de Romanowsky o el extendido fino no deben quedar al margen a la hora de realizar la evaluación pues es un método de diagnóstico rápido que permite una cuantificación del número de parásitos por microlitro de sangre, algo que no nos es posible desde la PCR anidada. Una ventaja añadida a técnicas como la gota gruesa es su facilidad y bajo coste, sobre todo cuando el diagnóstico debe realizarse en lugares que cuentan con recursos mínimos para el diagnóstico pudiendo dar así una primer asistencia y tratamiento al paciente6,7.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Paludismo [Internet]. Organización Mundial de la Salud. 2020 [citado 15 julio 2021]. Disponible en: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/malaria
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