Reproducción asistida y técnicas de mejora de semen.

AUTORES

1. Marta Sabanza Belloso. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
2. María Dolores Fuentes Marín. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
3. Gabriel Ciprian Negru. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
4. Beatriz Jiménez Moraleda. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
5. Ana Cristina Miguel Molinos. Técnico Superior de Laboratorio de. Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet (Zaragoza).
6. María López Gómez. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet.

RESUMEN

Las técnicas de recuperación de espermatozoides móviles son muy útiles, por un lado, como prueba complementaria al análisis del semen, con él, se obtiene una cantidad de espermatozoides móviles y se facilita un pronóstico del éxito que se puede obtener en reproducción en caso de inseminación y, por otro, en el laboratorio de reproducción asistida, el método de REM es el mismo que hay que hacer en el tratamiento del semen en el momento que se va a transferir a la paciente.

En especial los métodos Swim-up y Percoll se utilizan en reproducción asistida para inseminación conyugal y donante. Para el éxito de estos métodos de reproducción asistida, deben recuperarse más de 5 millones de espermatozoides móviles, aunque en algunos casos se puede realizar la inseminación con una recuperación inferior, aunque la probabilidad de fecundación puede disminuir.

PALABRAS CLAVE

Técnicas de recuperación de espermatozoides, infertilidad.

ABSTRACT

Motile sperm retrieval techniques are very useful, on the one hand, as a complementary test to semen analysis, with it, a quantity of motile spermatozoa is obtained and a prognosis of the success that can be obtained in reproduction in case of insemination is provided. and, on the other hand, in the assisted reproduction laboratory, the REM method is the same that must be done in the treatment of semen at the moment it is going to be transferred to the patient.

Especially the Swim-up and Percoll methods are used in assisted reproduction for conjugal and donor insemination. For the success of these assisted reproduction methods, more than 5 million motile sperm must be recovered, although in some cases insemination can be performed with a lower recovery, although the probability of fertilization may decrease.

KEY WORDS

Sperm retrieval techniques, infertility.

INTRODUCCIÓN-JUSTIFICACIÓN

Se calcula que la infertilidad afecta aproximadamente al 15% de las parejas en edad fértil, y aproximadamente el 21% de los casos se deben a un factor masculino, un 33% a un factor femenino, un 40% es de tipo mixto y el resto de origen idiopático. La esterilidad en la pareja está aumentando. Son varias las causas, entre ellas el estrés y el ritmo de vida actual, la exposición a sustancias tóxicas y, entre otros aspectos por la circunstancia de que en el mundo desarrollado las parejas se unen cada vez más tarde y con el envejecimiento disminuye la capacidad reproductora, por lo que cada vez con más frecuencia se recurre a la TRA (técnicas de reproducción asistida) para tener familia².

El trabajo que se realiza en el laboratorio de reproducción asistida es de vital importancia para el éxito final del tratamiento de reproducción y fecundación. La calidad y la resolución de la recuperación de espermatozoides, la habilidad y las punciones de gametos, el control de las atmósferas de laboratorio, el sistema de esterilización de todos los materiales, la calidad de los cultivos y, en general, todos los pasos que se siguen para el objetivo final de conseguir un embarazo son importantísimos para el éxito final.

OBJETIVO

Conocer las técnicas y métodos de mejora del semen utilizadas en los laboratorios clínicos.

MATERIAL Y MÉTODO

Los principales manuales consultados tratan la reproducción asistida. Las fuentes fiables escritas por diferentes expertos proporcionan la base científica necesaria para el adecuado desarrollo teórico de éste artículo. Así mismo, el conjunto de las fuentes consultadas son actuales aportando una visión lo más real posible sobre la reproducción asistida y las técnicas de mejora de semen.

RESULTADOS

Es importante mencionar las técnicas de mejora de semen en el laboratorio antes de continuar con las técnicas y métodos de reproducción asistida ya que, para cualquier técnica que utilice semen se precisa previamente un tratamiento para mejorarlo. Las técnicas de recuperación de espermatozoides móviles (REM) son muy útiles para orientar sobre el tratamiento más adecuado y para decidir la elección de una u otra técnica de reproducción asistida. Consiste en realizar en el volumen total del eyaculado una selección para obtener sólo los espermatozoides con movilidad progresiva, es decir, una REM, separándolos para ello del resto del semen.

Hay varias técnicas de mejora del semen; unas se basan en la movilidad del esperma y otras en su densidad. Las dos más importantes son: el Swim-up que significa (nadar hacia arriba) y los gradientes de Percoll.

Métodos basados en la movilidad del esperma:

Swim-up: Consiste en la separación de los espermatozoides móviles al hacerles migrar a un medio de cultivo como RPMI, HANS-F10 o similares. Suelen ser medios que contienen sales minerales, vitaminas, azúcares, aminoácidos y tampones para ajuste de Ph a 7´4; suelen contener también antibióticos para su mejor conservación, pero no es preciso añadir antibióticos en caso de que vaya a usarse como prueba de diagnóstico, lo que sí se hará para la inseminación inmediata, pasándolo también por un filtro estéril.

La técnica es la siguiente¹,

• Realizar previamente una valoración del semen inicial, informando sobre el recuento, volumen y porcentajes de movilidad.
• Centrifugar 1 ml de esperma con 3-5 ml. De RPMI a 1.800/2.000 RPM durante unos 8 minutos. Se trata de un lavado para retirar el plasma seminal.
• Retirar el sobrenadante.
• Añadir 0´5 ml. De medio de cultivo como RPMI al pellet (sedimento sobrante), con cuidado de no romperlo.
• Incubar 15-30 minutos, según la concentración de espermas móviles del semen inicial, a 37 grados en atmósfera del 5% CO2 (estufa de cultivos). Los espermatozoides con mejor movilidad irán ascendiendo hacia el medio de cultivo.
• Aspirar el sobrenadante, donde se encuentra la mayoría de los espermatozoides móviles.
• Observar a 40x en cámara de Macler, microcell o similar: Contar los espermas recuperados (expresados en millones/mililitros) y definirlos como REM.

Swim-Down: Similar al método anterior, se realiza una modificación en el medio de cultivo al espesarlo con dextranos, por lo que el semen, en vez de depositarse en el fondo como el swim-up, flota en la parte superior, migrando los espermas hacia el medio, que actúa como un filtro, actualmente tiene poco uso.

Dextrano: En este caso se espesa el semen con dextrano, quedando el medio en la parte superior, también con poco uso.

Métodos basados en la densidad de los espermatozoides. Gradientes de Percoll:

Consiste en centrifugar el semen para que pase a través de un coloide de distintos gradientes de densidad, para que los espermas de más densidad que corresponden a los espermatozoides vivos se depositen en el fondo del tubo y después facilitar su separación en las capas superiores. Antiguamente se empleaba percoll pero se prohibió su uso para la reproducción en humanos hace algunos años por los posibles efectos tóxicos en los espermatozoides. Actualmente se utilizan otros coloides como PureSperm o SpermGrad. Para facilitar la realización de la prueba, se utilizan sólo dos gradientes de 47 y 60 de densidad, esta técnica se ha llamado Minipercoll¹.

Reactivos:

• Percoll del 47%.
• Percoll del 90%.
• Tampón de lavado.

Método:

• Realizar valoración del semen inicial, informando del recuento, volumen y los porcentajes de movilidad.
• En un tubo de ensayo poner en el siguiente orden:

-1 ml de percoll del 90%.

-1 ml de percoll del 47%.

-1 ml de semen.

• Centrifugar a 2.000 rpm 20-30 minutos.
• Separar las capas y dejar el sedimento.
• Añadir al pellet 0´5 ml de tampón de lavado o un medio de cultivo como RPMI.
• Agitar y centrifugar a 3.000 rpm para lavarlo.
• Quitar el sobrenadante.
• Al pellet añadir 0´5 ml de RPMI.
• Contar en cámara MACLER o similar. Informar sólo los móviles en millones.

Métodos biológicos:

Por fijación de un anticuerpo específico a un antígeno específico del espermatozoide y posterior separación. Método poco usado.

CONCLUSIONES

La esterilidad en la pareja está aumentando. Son varias las causas, entre ellas el estrés y ritmo de vida actual, la exposición a sustancias tóxicas y, entre otras causas, por la circunstancia de que en el mundo desarrollado las parejas se unen cada vez más tarde y con el envejecimiento disminuye la capacidad reproductora, por lo que con mayor frecuencia se recurre a la TRA para tener familia.

Las técnicas de recuperación de espermatozoides móviles (REM) son muy útiles para orientar sobre el tratamiento más adecuado y para decidir la elección de una u otra técnica de reproducción asistida. Consiste en realizar en el volumen total del eyaculado una selección para obtener sólo los espermatozoides con movilidad progresiva, es decir, una REM, separándolos para ello del resto del semen.

Hay varias técnicas de mejora del semen; Unas se basan en la movilidad del esperma y otras en su densidad. Las dos más importantes son: el Swim-up que significa (nadar hacia arriba) y los gradientes de Percoll. Ambos métodos se utilizan en reproducción asistida para inseminación conyugal y donante.

BIBLIOGRAFÍA

1. ESHRE. Guidelines on the application of CASA technology in the analysis of spermatozoa. Hum Reprod. 1998;13:142-5.
2. World Health Organization, WHO. Laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5^th ed. Cambrige: Cambrige University press, 2010.