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Metodologías actuales para la detección de covid-19

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28 enero 2021

AUTORES

  1. Margarita Elu Escalante. Primer Autor. Técnico Superior En Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  2. Noemí Pérez Caamaño. Técnico Superior En Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  3. Alba Berrocal Elu. Diplomado Universitario De Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  4. Violeta Pedragosa González. Grado Universitario En Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  5. Daniel Candala Ramírez. Grado Universitario En Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  6. Guillermo Sánchez Barrón. Grado Universitario en Enfermería. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.

 

RESUMEN

En diciembre del 2019 surgió en la ciudad de Wuhan (provincia de Hubei, China) una epidemia de neumonía viral de etiología desconocida. La primera secuencia del genoma del agente infeccioso responsable de esta epidemia se realizó en enero 2020 y se pudo identificar al virus como un coronavirus SARS-CoV-2, muy similar al coronavirus responsable del Síndrome Agudo Respiratorio Grave (SARS).

Y el 11 de marzo del 2020, la OMS anuncia el estado de una pandemia desencadenada por la propagación de este coronavirus responsable de la nueva enfermedad infecciosa respiratoria COVID-19.

Dada la situación epidemiológica actual se debe realizar la confirmación diagnóstica de todos los casos sospechosos de COVID-19. Para ello se dispone de diferentes tipos de test para detectarlos usando metodologías de pruebas rápidas, serológicas y/o moleculares.

 

PALABRAS CLAVE

Coronavirus, SARS-CoV-2, COVID19, biología molecular, RT-PCR.

 

ABSTRACT

In December 2019, an epidemic of viral pneumonia of unknown etiology emerged in the city of Wuhan (Hubei province, China). The first sequence of the genome of the infectious agent responsible for this epidemic was carried out in January 2020 and the virus could be identified as a SARS-CoV-2 coronavirus, very similar to the coronavirus responsible for Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS).

And on March 11, 2020, the WHO announces the status of a pandemic triggered by the spread of this coronavirus responsible for the new respiratory infectious disease COVID-19.

Given the current epidemiological situation, diagnostic confirmation of all suspected cases of COVID-19 must be carried out. For this, different types of tests are available to detect them using rapid, serological or molecular test methodologies.

 

KEY WORDS

Coronavirus, SARS-CoV-2, COVID19, molecular biology, RT-PCR.

 

INTRODUCCIÓN

Características del coronavirus:

Ortho Coronaviridae conocido como coronavirus, es un virus ARN monocatenario perteneciente a la familia Coronaviridae. Está formado con una nucleocápside de simetría helicoidal con envoltura.​ Se les da el nombre de coronavirus por la corona de puntas que lleva alrededor de su superficie.

Por secuenciación genética el SARS-CoV-2 es homólogo en el 96% a un virus identificado en los murciélagos capturados en China. No hay evidencias confirmatorias que avalen que el reservorio animal del SARS-CoV-2 sea de los quirópteros. Y se baraja la hipótesis que el salto entre el murciélago y el hombre se ha producido a través del mamífero pangolín.

El síndrome respiratorio agudo coronavirus-2, es el séptimo coronavirus que se conoce que infecta a los humanos, siendo altamente contagioso y se ha expandido rápidamente en todo el mundo desde su descubrimiento.

El tiempo de incubación está en torno a 5-6 días, con extremos de entre 2-12 días, lo cual acredita el período de cuarentena de hasta 10 días .1,2

El virus de la COVID-19 se propaga principalmente a través de las gotículas de saliva (Flugge o Weiss), de aerosoles y de las secreciones nasales que se generan cuando una persona infectada tose o estornuda. Está comprobado que la mejor manera de prevenir y frenar la transmisión es llevando una mascarilla para protegerse a sí mismo y a los demás contra la infección. Además es fundamental lavarse las manos con frecuencia, mantener las distancias y usar un gel hidroalcohólico.

 

Manifestaciones clínicas:

La sintomatología de las personas infectadas por el virus de la COVID-19 presenta en mayor parte cuadros respiratorios leves a moderados y logran recuperarse sin tratamiento específico. Cierto es que las personas mayores así como las que presentan afecciones añadidas (diabetes, obesidad, enfermedades cardiovasculares, respiratorias crónicas o inmunodeficiencias) tienen más posibilidades de tener un cuadro grave.

Los signos de la infección incluyen síntomas respiratorios como dolor de cabeza, tos, fiebre, disnea, anosmia, ageusia. Los casos más graves presentan neumonía, síndrome respiratorio agudo con complicaciones multiorgánicas y la muerte.3

 

OBJETIVO

El objetivo de esta revisión bibliográfica es poner en conocimiento las principales y diferentes técnicas para el diagnóstico del COVID-19 que existen en la actualidad.

 

METODOLOGÍA

Se ha realizado una revisión bibliográfica de literatura científico-sanitaria en bases de datos como Scielo, Elsevier, y MedlinePlus. Como buscador se ha utilizado Google Académico, así como páginas web de organismos oficiales tales como la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas (SEIMC) y el Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social del Gobierno de España.

 

RESULTADOS

Técnicas empleadas en el Laboratorio para el diagnóstico microbiológico:

En la actualidad y desde el laboratorio se utilizan diferentes pruebas para el diagnóstico de infección por coronavirus y por ello se está empleando una amplia gama de técnicas moleculares, así como inmunológicas.

Podemos contar con diferentes metodologías entre las cuales se encuentran:

  • Test rápidos (Inmunocromatografía coloidal/Flujo Lateral)
  • Pruebas serológicas (Inmunoensayo tipo ELISA/Quimioluminiscencia).
  • Pruebas moleculares o RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real).

 

Inmunocromatografía coloidal / Flujo Lateral: 2,4

La principal técnica empleada para la detección de antígenos (proteínas del virus) y anticuerpos (IgM/IgG) es la inmunocromatografía. Los ensayos de flujo lateral inmunocromatográfico (ICT) son conocidos como Test rápidos (cualitativo) y con ese método se obtiene un resultado en 15 minutos.

Estos Kits tienen las propiedades diagnósticas y las características necesarias para su implementación como Point of Care (POC) en Atención Primaria así como en la Urgencia de los centros hospitalarios.

  • ICT para detección de antígenos:

Su técnica se fundamenta en la migración de la muestra empleada a través de una membrana de nitrocelulosa que se deposita en un pocillo donde está el conjugado formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno motivo de la búsqueda. Se tomará una muestra del tracto superior con la ayuda de un hisopo nasofaríngeo en pacientes asintomáticos desde 0 hasta más de 5 días de evolución.

En cuanto a su especificidad está entre el 90% y 99 %.

Interpretación del resultado: 5

  • Siempre debe de aparecer una línea a modo de control para así demostrar su correcto funcionamiento.
  • Al migrar la muestra a la zona de captura quedarán retenidos los complejos formados entre la unión del antígeno y el conjugado y entonces una línea se coloreará a modo de presencia.
  • ICT para detección de anticuerpos:

Se utilizan para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG a través de una gota de sangre mediante venopunción o por punción en el pulpejo del dedo de la mano. Se recomienda usar ésta técnica en pacientes con una evolución de la infección superior a los 7 días después del inicio de los síntomas ya que su sensibilidad es muy variable de ahí la limitación de su diagnóstico frente a técnicas más sensibles:

  • 1-5 d: 75%.
  • 6-10 d: 50-75%.
  • 10-20 d: >75%.
  • 20 d: >90%.

Interpretación del resultado: 5

  • La aparición de líneas para IgG o IgM, o ambas, indica una muestra positiva y por lo tanto, que el paciente ha tenido una respuesta inmunológica del paciente frente al virus y no el virus en sí.
  • De lo contrario, migrarán muestra y conjugado sin unirse por lo que no habrá coloración de ninguna línea sabiendo así que el paciente no ha tenido respuesta inmunológica alguna.

 

Prueba serológica Anti-SARS-CoV-2 por quimioluminiscencia:6

Para muestras serológicas la toma se hará con una extracción de sangre en tubo con separador de gel. Una vez llegada la muestra al laboratorio se procederá a su centrifugación para después hacerle pruebas serológicas con el fin de detectar la presencia de anticuerpos específicos contra el SARS.CoV-2.

La luminiscencia es la emisión de luz asociada a la disipación de una sustancia electrónica excitada. En quimioluminiscencia (CLIA), los compuestos químicos emiten luz cuando se oxidan con los peróxidos. La reacción mediante uso de quimioluminiscencia proporciona una alta sensibilidad analítica.

La prueba serológica permite hallar si una persona ha desarrollado una reacción inmunitaria después de haber estado en contacto con el virus.

Se podrá determinar diferentes inmunoglobulinas:

  • IgT son los anticuerpos Totales (IgG e IgM) dirigidos contra la nucleocápside de SARS-CoV-2. En la mayoría de los casos aparecen antes que los anticuerpos totales dirigidos contra la espícula del SARS-CoV-2 (IgG).
  • IgG son anticuerpos dirigidos contra la espícula del SARS-CoV-2. Es la inmunoglobulina más importante en la respuesta secundaria (memoria).
  • IgM aunque no esté aún confirmado, estos anticuerpos podrían estar dirigidos hacia la espícula del SARS-CoV-2. Son de aparición temprana ya que se sintetizan precozmente y desempeñan una función predominante en la respuesta inmunitaria primaria (fase aguda).
  • IgA son marcadores de infección aguda.

 

Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR):

La toma más óptima para la recolección de la muestra con el fin de hacer un diagnóstico microbiológico de SARS-CoV-2 será preferentemente la del tracto respiratorio superior. El frotis nasofaríngeo es el más adecuado ya que es donde se concentra la mayor carga viral. Se introducirá por ambas fosas nasales un hisopo de dacrón o poliéster hasta llegar a la rinofaringe y se retirará una vez absorbidas las secreciones. Se sumergirá el hisopo en un tubo estéril que contiene un medio de transporte viral y se conservará en nevera hasta su transporte al laboratorio.7

La reacción en cadena de la polimerasa fue ideada en 1980 por Kary B. Mullis a quién la Real Academia Sueca otorgó el Premio Nobel de Química en 1993. Su fundamento se basa en replicar varios millones de veces una pequeña secuencia diana de ácidos nucleicos (un segmento de ADN) a través de ciclos repetitivos.1

La RT-PCR es un un proceso de amplificación selectiva y enzimática “in vivo” que transcribe el ARN en ADN complementario a la secuencia diana gracias a la retranscriptasa inversa. Esta técnica cuantitativa de biología molecular es realizada por el Técnico Superior de Laboratorio en Diagnóstico Clínico y detecta directamente la presencia de ARN en el virus SARS-Co-V-2 a través de su material genético. Lo hace amplificando dianas situadas en los genes S Spike, la Nucleocápside N o en la envoltura E del virus, ORF1, RdRP, que transcriben proteínas.

Aunque normalmente las casas comerciales suministran los kits de PCR con las master mix que contienen todos los reactivos necesarios, los componentes para realizar la técnica son:

  • Muestra de exudado nasofaríngeo/orofaríngeo.
  • Taq polimerasa (ADN polimerasa) proviene de la bacteria Thermus aquaticus.
  • Oligonucleótidos de cadena sencilla, complementarios a las secuencias conocidas de ADN diana, primers o cebadores.
  • Desoxinucleótidos trifosfatos complementarios correspondientes del ADN molde, dNTP.
  • Cloruro de magnesio (MgCl2).
  • Retrotranscriptasa Inversa.

Con la ayuda de un termociclador que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reacción en cadena de la polimerasa se puede obtener del orden de unas 35 millones de copias de ADN viral por cada cadena de ARN viral en origen.5

Podemos resumir este proceso en varias etapas:

  • Extracción y purificación de la molécula.
  • Desnaturalización de la doble hélice: separación de las dos cadenas del ADN.
  • Hibridación (Annealing/alineamiento): unión de los primers a sus secuencias complementarias de la muestra de ADN.
  • Extensión/elongación del complejo cebador ADN: por cada molécula molde de ADN inicial se generan dos moléculas molde de ADN en el primer ciclo repitiendo el proceso entre 35 y 40 ciclos.

La detección se realiza a través de la retrotranscripción y posterior amplificación a tiempo real de las secuencias diana. La identificación del SARS-CoV-2 se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando oligonucleótidos específicos y una sonda marcada con fluoróforos capaces de unirse al ADN amplificado (que hibridan en una región diana) y así producir luz. Esta reacción genera un aumento en la señal fluorescente exponencial a la cantidad de ARN diana(N, E, S, ORF1, RdRP).

El resultado de la RT-PCR registra el número de ciclos de temperatura (Cycle Treshold) que han sido necesarios para señalar el umbral de detección del ADN. De tal modo, cuantos menos ciclos de temperatura obtenidos, antes se habrá amplificado y estará presente en la muestra. Esta prueba no informa de la inmunidad sino solo de la transmisibilidad.8

 

CONCLUSIÓN

La prueba de inmunoensayo de flujo lateral es extremadamente rápida ya que nos aporta el resultado en 15 minutos y puede detectar la presencia o no del virus. Sin embargo, no es aconsejable introducir en la rutina de diagnóstico los test rápidos que se están utilizando ya que no tienen una total fiabilidad y su insuficiente sensibilidad y especificidad no sitúan esta prueba como método de cribado. Entre las desventajas de su resultado se incluye una gran variabilidad en función del curso de la enfermedad ya que en las primeras fases de la infección, el cuerpo no ha generado anticuerpos frente a la enfermedad, por lo que no son detectables.

Las pruebas que detectan anticuerpos, solo indica contacto previo con el virus, pero no permiten demostrar ni descartar su presencia en el momento en que se toma la muestra, y tampoco indican protección contra el virus. Solo puede determinar si el paciente ha sido infectado en algún momento con COVID-19 y será necesario verificar si está actualmente infectado con la ayuda de una PCR.

La RT-PCR es una técnica muy laboriosa que requiere personal cualificado, es muy sensible y permite obtener millones de copias partiendo de una sola cadena de ARN/ADN. También es muy específica, ya que sólo amplifica la secuencia que se quiere sintetizar. Presenta alta precisión y exactitud. Tiene grandes ventajas ya que puede detectar infecciones en curso.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. L´Institut Pasteur. Maladie Covid-19 (nouveau coronavirus). 25 junio 2020

Disponible en: https://www.pasteur.fr/fr/centre-medical/fiches-maladies/maladie-covid-19-nouveau-coronavirus

2. García F, Melón S, Navarro D, Paño JR, Galán JC. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Organización del diagnóstico de SARS-CoV-2 y estrategias de optimización V 1.0; 2020. Disponible en: https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/recomendaciones/seimc-rc-2020-COVID19-OrganizacionDiagnostico.pdf

3. Organización Mundial de la Salud. Disponible en: https://www.who.int/es/health-topics/coronavirus#tab=tab_1

4. Grupo de expertos SEIMC para el análisis del diagnóstico microbiológico del COVID-19. Junta Directiva SEIMC Recomendaciones de SEIMC sobre el uso de las pruebas de detección de anticuerpos 27 de abril del 2020. Disponible en:

https://seimc.org/contenidos/documentoscientificos/recomendaciones/seimc-rc-2020-Recomendaciones_uso_de_las_pruebas_de_deteccion_de_anticuerpos.pdf

5. Labclinics. Tipos de test para detectar el COVID-19. 22 de abril 2020. Disponible en: https://www.labclinics.com/tipos-de-tests-para-detectar-el-covid-19/

6. Michael J. Mina, Kristian G. Andersen et al. Prueba COVID-19: una talla no sirve para todos Science [internet]science. abe9187; 2021 [citado 08 de enero de 2021]; 371(6525):126-127

Disponible en: https://science.sciencemag.org/content/371/6525/126.summary

7. Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social. Disponible en: https://www.mscbs.gob.es/profesionales/saludPublica/ccayes/alertasActual/nCov/documentos/202005018_Toma_muestras.pdf

8. D´Ocon Navaza C, García García-Saavedra MJ, Vicente García JC. Fundamentos y Técnicas de Análisis Bioquímica. Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Paraninfo: 2006; p339-47.