Maldi y espectrofotometría de masas para tipificación e identificación de patógenos.

AUTORES

1. Sheila María Benito Galindo. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Lozano Blesa. Zaragoza.
2. Aída Pérez Bona. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud.
3. Carla del Amo Arregui. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud.
4. María Clara Ormazabal Cundin. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud.
5. Macarena Hidalgo de la Cruz. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud.
6. Marta Salas Ostale. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Lozano Blesa. Zaragoza.

RESUMEN

La tecnología MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) incorporada recientemente en el laboratorio de microbiología ha demostrado ser un método rápido y preciso para la identificación bacteriana. Esta técnica se basa en la identificación de microorganismos mediante la creación de un espectro basado en el perfil de proteínas, que es único para una especie dada. La espectrometría de masas MALDI-TOF MS demostró ser una técnica rápida, sencilla y precisa, que requiere un menor coste que otros métodos de identificación de microorganismos^1,2.

PALABRAS CLAVE

MALDI-TOF, espectometría de masas, microbiología, identificación bacteriana.

ABSTRACT

The MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) technology recently incorporated in the microbiology laboratory has proven to be a fast and accurate method for bacterial identification. This technique is based on the identification of microorganisms by creating a spectrum based on the protein profile, which is unique for a given species. MALDI-TOF MS mass spectrometry proved to be a fast, simple and accurate technique, requiring a lower cost than other methods for identifying microorganisms.

KEY WORDS

MALDI-TOF, mass spectrometry, microbiology, bacterial identification.

INTRODUCCIÓN

La espectrometría de masas MALDI-TOF es una de las técnicas más utilizadas en la rutina de los laboratorios para la identificación de microorganismos, tanto de bacterias, como mycobacterium, levaduras y hongos filamentosos.

Es una técnica de determinación estructural que permite estudiar la distribución de las moléculas de una sustancia en función de su masa. Un espectro de masas es una relación de las especies iónicas presentes en una muestra, expresadas en función de su masa/carga (m/z) y la abundancia relativa (intensidad) de cada una en la muestra. La espectrometría de masas fue utilizada históricamente como una técnica analítica de la química clínica, pero no fue hasta hace tres décadas con la aparición de las técnicas de “ionización suave” cuando se consiguió analizar biomoléculas de gran tamaño utilizando un láser como fuente de ionización y una matriz orgánica para facilitar el proceso. De ahí el nombre MALDI-TOF que obedece a las siglas Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight o ionización-desorción asistida por matriz con tiempo de vuelo. Esta diferencia respecto de otro tipo de espectrómetros es la que va a permitir que se produzcan muchas menos fragmentaciones en la muestra y que la interpretación del espectro generado sea más sencilla. Cuánto más grande es la molécula que se quiere analizar, más complejo es el proceso de análisis cuando esta se fragmenta en múltiples iones.

OBJETIVO

El principal objetivo es dar a conocer esta técnica y la importancia que ha tenido el descubrimiento de esta técnica a la hora de identificar los microorganismos patógenos en el laboratorio de microbiología. Para ello, se plasmará información actualizada sobre dicha técnica, exponiendo sus características más notables y el procedimiento para realizarla.

METODOLOGÍA

Esta revisión bibliográfica se ha realizado consultando información considerada relevante en distintas bases de datos como son Scielo, Medline y Elsevier. Se han utilizado Google Académico y Pubmed como buscadores de bibliografía para poder comparar los diferentes artículos y publicaciones.

RESULTADOS

Los sistemas de tipificación bacteriana engloban un conjunto de métodos microbiológicos que permiten diferenciar cepas pertenecientes a una misma especie. El objetivo final de cualquiera de estos métodos es establecer la relación entre aislamientos vinculados epidemiológicamente. Este tipo de análisis posibilita, entre otros aspectos, el estudio de brotes hospitalarios facilitando tanto su detección precoz como la caracterización de modelos de transmisión de infecciones entre personas y el diseño de medidas de control.

Para llevar a cabo el análisis de una muestra para identificar de qué patógeno se trata tendremos que hacer una siembra para obtener colonias aisladas. Una vez lo tengamos elegiremos la colonia que queremos identificar. Un inóculo tomado a partir de una colonia aislada en cultivo puro se deposita por duplicado sobre una tarjeta de análisis y se deja secar a temperatura ambiente. Luego, los pocillos se cubren con matriz (solución saturada de ácido alfa-ciano-4hidroxinámico en 50% acetonitrilo y 2,5% ácido trifluoruro-acético). Para la calibración del espectrómetro se utiliza una prueba estándar consistente en el perfil proteico de una cepa de Escherichia coli. En alto vacío, es tratada con pulsos de luz láser provocando que la matriz absorba esta energía y la convierta en energía de excitación y transferencia de iones al analito. El área tratada se calienta y se provoca la desorción de iones de fase sólida a gaseosa. Los espectros para cada aislado se obtienen con disparos del láser en seis regiones distintas en el mismo pocillo. Los espectros son creados considerando el tiempo requerido por las proteínas para llegar al detector, lo que depende de la relación masa/carga de éstas. Cada espectro, al ser comparado con la base de datos, permite la asignación de un puntaje, indicando identificación a nivel de especie, identificación confiable sólo a nivel de género o no permiten identificación¹.

Esencialmente, un espectrómetro de masas debe ser capaz de desempeñar cuatro funciones: vaporizar sustancias de volatilidades muy diferentes, originar iones a partir de las moléculas neutras en fase gaseosa, separar los iones en función de su relación carga/masa, identificar los iones separados y registrar la información adecuadamente.

Un espectrómetro de masas se divide en tres unidades funcionales:

• Una fuente para ionizar la muestra y transferirla a fase gaseosa.
• Un analizador de masas: comúnmente se utiliza el analizador TOF (time of flight) que mide muy precisamente el tiempo de vuelo de los iones desde que son acelerados, por la fuente, hasta que impactan el detector.
• Un dispositivo de detección de iones separados³.

CONCLUSIONES

El aprovechamiento óptimo de las posibilidades que nos ofrece la espectrometría de masas MALDI-TOF en su nivel de desarrollo actual, junto con el resto de las técnicas de diagnóstico rápido disponibles, plantea un retp fundamental desde el punto de vista científico-técnico, pero también desde el punto de vista organizativo de la microbiología clínica. El diagnóstico rápido debe ser una de las prioridades estratégicas de todos los servicios clínicos y debe estar incluido en un sistema multidisciplinar en el que la unidad de MALDI-TOF tenga una comunicación fluida y continuada con las distintas secciones del laboratorio de microbiología para satisfacerla demanda diagnóstica⁴.

En conclusión, podemos decir que la metodología MALDI-TOF MS constituye una herramienta útil y confiable para identificar correctamente a nivel de especie y en forma rápida aislamientos bacterianos, es de fácil uso y de menor coste que otros métodos usados en el laboratorio.

BIBLIOGRAFÍA

1. Paulette Legarraga, Marcela Moraga, Marusella Lam, Enrique Geoffroy, Cecilia Zumarán y Patricia García. Impacto de la espectrometría de masas por MALDI-TOF MS en la identificación rápida de bacterias aeróbicas y anaeróbicas de importancia clínica. Revista chilena de infectología. Volumen 30 nº2. 2013.
2. María S. Relloso, Jimena Nievas, Santiago Fares Taie, Victoria Farquharson, María T. Mujica, Vanesa Romano, Mariela S. Zarate, Jorgelina Smayevsky. Evaluación de la espectrometría de masas: MALDI-TOF MS para la identificación rápida y confiable de levaduras. Revista Argentina de microbiología. Volumen 47 nº2, 2015.
3. Elena Jordana-Llunch, Elisa Martró Catalá, Vicente Ausina Ruiz. La Espectrometría de Masas en el laboratorio de Microbiología Clínica. Revista de Enfermedades Infecciosas y Microbiología clínica. Volumen 30 nº2. 2016.
4. Juan Carlos Rodriguez, Miguel Ángel Bratos, Esperanza Merino, Carmen Ezpeleta. Utilización de MALDI-TOF en el diagnóstico rápido de sepsis. Revista de Enfermedades Infecciosas y Microbiología clínica. Volumen 34 nº2. 2016.