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Diagnóstico y tipos de PCR. Revisión bibliográfica.

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3 agosto 2021

AUTORES

  1. Beatriz Jiménez Moraleda. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  2. María Dolores Fuentes Martín. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  3. Marta Sabanza Belloso. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  4. María López Gómez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  5. Ana Cristina Miguel Molinos. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  6. Gabriel Ciprian Negru. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.

 

RESUMEN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de ADN. El método utiliza secuencias cortas de ADN llamadas cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada. Con esta técnica se pueden producir un billón de copias de la secuencia en estudio en sólo unas pocas horas.1

 

PALABRAS CLAVE

Reacción en cadena de la polimerasa, diagnóstico, ADN.

 

ABSTRACT

Polymerase chain reaction (PCR) is a laboratory technique used to amplify DNA sequences. The method involves using short DNA sequences called primers to select the portion of the genome to be amplified. The temperature of the sample is repeatedly raised and lowered to help a DNA replication enzyme copy the target DNA sequence. The technique can produce a billion copies of the target sequence in just a few hours.1

 

KEY WORDS

Polymerase chain reaction, diagnosis, DNA.

 

INTRODUCCIÓN

Algunas veces llamada “fotocopiado molecular”, la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es una técnica rápida y económica utilizada para “amplificar” – copiar – pequeños segmentos de ADN. Debido a que se necesitan considerables cantidades de una muestra de ADN para análisis moleculares y genéticos, los estudios de segmentos aislados de ADN son casi imposibles sin la amplificación por PCR.2

 

OBJETIVO

El objetivo principal de esta revisión bibliográfica es conseguir una comprensión más precisa de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, una técnica común en el laboratorio que ha tomado protagonismo con el diagnóstico del COVID-19.

 

METODOLOGÍA

Esta revisión bibliográfica se ha llevado a cabo recabando aquella información que se ha considerado relevante en distintas bases de datos como son Scielo, Elsevier y Medigraphic. Como buscadores de bibliografía se ha utilizado Google Académico y Pubmed lo que ha ofrecido la posibilidad de consultar contenidos de MEDLINE, así como una amplia gama de revistas científicas relacionadas con investigaciones biomédicas.

 

RESULTADOS

La reacción en cadena de la polimerasa, abreviada PCR, se ha popularizado en el lenguaje coloquial a raíz de la pandemia de COVID-19, pero su uso en laboratorio es muy habitual desde hace muchos años, para usos que van desde la secuenciación del ADN hasta la generación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, pasando por la identificación de patógenos gracias a la detección de la ausencia o presencia de sus genes.3

 

La PCR nace de la dificultad de estudiar trozos de ADN aislados en análisis que requieren cantidades significativas de material genético; se basa en una actividad enzimática que en las células del organismo se produce de forma natural. Para amplificar un segmento de ADN utilizando la PCR, primero se calienta la muestra para la desnaturalización del ADN, es decir para que se separen las dos hebras. Luego, una enzima llamada “polimerasa Taq” sintetiza – construye – dos nuevas hebras de ADN, utilizando las hebras originales como plantillas. Este proceso resulta en la duplicación del ADN original, en la que cada una de las nuevas moléculas contiene una hebra vieja y una hebra nueva de ADN. Entonces, cada una de estas hebras puede usarse para crear dos copias nuevas, y así sucesivamente. El ciclo de la desnaturalización y síntesis del nuevo ADN se repite tantas como 30 o 40 veces, dando lugar a más de mil millones de copias exactas del segmento de ADN original.2,3

 

El proceso de ciclado completo de la PCR es automático y puede completarse en tan sólo unas pocas horas. El proceso es dirigido por una máquina llamada termociclador, que está programada para cambiar la temperatura de la reacción cada pocos minutos para hacer posible la desnaturalización y síntesis del ADN.2

 

Usos de la reacción en cadena de la polimerasa:

Una vez amplificado, el ADN obtenido por PCR se puede usar en muchos procedimientos de laboratorio diferentes. Por ejemplo, la mayor parte de técnicas de mapeo del Proyecto del Genoma Humano se basaban en la PCR.3

 

Además, también se usa para determinar: pruebas de paternidad, análisis forenses, detección de microorganismos y el diagnóstico de trastornos genéticos.3

Ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa:

  • Rapidez en la respuesta: tarda tan sólo unas horas en arrojar resultados.
  • Sensibilidad: la PCR permite detectar microorganismos en una concentración muy baja, ayudando a reducir falsos negativos.3

 

Material necesario para PCR:

  • Una plantilla de ADN: el ADN que se debe copiar, que generalmente se extrae y se purifica de la sangre o de otro tejido.3
  • Cebadores o iniciadores (primers): oligonucleótidos monocatenarios, que poseen de 20 a 30 bases de longitud, que se unen a la plantilla de ADN por los extremos para que la polimerasa inicie la reacción para empezar a sintetizar el material genético. Se necesitan dos cebadores para la PCR, cada uno de ellos complementario a una cadena de ADN que queremos amplificar, y delimitan la zona del ADN a amplificar. Estas dos hebras de ADN separadas son complementarias, y van en sentido opuesto (desde un extremo, el extremo 5 ‘, al otro, el extremo 3’); de manera que hay dos primers: uno directo y uno inverso, es decir, que corresponden a:3
    • Un ADN polimerasa: para sintetizar el ADN. La ADN polimerasa Taq proviene de bacterias que pueden llegar a temperaturas superiores a los 90ºC, por lo que que puede soportar las temperaturas necesarias para romper las hebras de ADN en la etapa de desnaturalización del ADN.3
    • dNTP (Trifosfatos de desoxirribonucleótidos): los componentes básicos del ADN son 4 tipos de nucleótidos, integrados por 4 bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina), por lo que para poder obtener nuevas moléculas de ADN (las copias) son indispensables estos componentes.3
    • Solución tampón: Utilizada para regular el pH, imitando las condiciones de acidez o basicidad en las que se produce la síntesis del material genético.3
    • Solución de sal de cloruro de magnesio: el cloruro de magnesio se disocia y se libera magnesio, cuyos iones de carga positiva (+2) se usan como cofactores de la polimerasa.3
  • Termociclador: equipo programado para alterar la temperatura de la reacción cada pocos minutos para permitir la desnaturalización y síntesis del ADN, de manera que el proceso completo finalice en cuestión de pocas horas.3

 

Etapas de la PCR:

1. Desnaturalización del ADN: Es el momento en el que la plantilla de ADN de doble cadena se calienta para separarlo en dos cadenas simples. Se calienta a 94-95ºC, durante 15-30 segundos, haciendo que los enlaces de hidrógeno entre las bases en dos cadenas de ADN se rompan y las dos se separen. 3

2. Alineación del ADN: Se baja la temperatura a 50-65ºC, durante 10-30 segundos, para permitir que los cebadores (primers) de ADN se adhieran a la plantilla de ADN monocatenario mediante enlaces de hidrógeno.3

3. Ampliación del ADN: Aumenta la temperatura a 72ºC, durante 1 minuto, La Taq polimerasa construye la hebra complementaria. Se adhiere al primer y luego agrega bases de ADN a la hebra individual una por una en la dirección 5´ a 3´.3

 

Repeticiones:

La reacción en cadena de la polimerasa requiere repetir estos tres procesos o ciclos térmicos de 20 a 40 veces, duplicando el número de copias de ADN cada vez. Los nuevos fragmentos de ADN que se generan durante la PCR a su vez sirven como plantillas a las que la polimerasa puede unirse y comenzar a generar más ADN.3

Tipos de reacción en cadena de la polimerasa:

Hoy en día existen numerosas variaciones de la reacción en cadena de la polimerasa, según el objetivo y los requisitos que se tenga. Las más habituales son:3

  • PCR anidada: Variante de la PCR convencional que comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.4
  • PCR in situ: Se marca una hebra sencilla de ARN o ADN denominada sonda y se permite que se empareje con su secuencia complementaria en el ARN o el ADN presente en una muestra de tejido o de cromosomas. La sonda está marcada con una sustancia trazadora química o radiactiva por lo que su unión puede ser visualizada.5
  • PCR múltiple: lo que se persigue es amplificar simultáneamente en un único tubo distintas secuencias específicas, lo cual necesariamente implica que los reactivos mezclados y el programa utilizado sean suficientes y adecuados para permitir la detección de cada diana y no inhibir la de las demás. Es necesario tener en cuenta:6
    • Escoger o diseñar oligonucleótidos que no interaccionen entre sí, es decir, que no forman oligómeros.
    • Que tengan temperaturas de anillamiento similares.
    • Que cada pareja amplifique una única secuencia diana.
    • Que generen amplicones de tamaño suficientemente diferente como para poder ser separados y diferenciados tras la amplificación.
    • En cuanto a la calidad y cantidad de ADN molde, por supuesto debemos intentar partir de la menor concentración posible y con ausencia de sustancias inhibidoras que puedan interferir en la reacción. Para ello, los protocolos de purificación variarán en función del tipo de muestra clínica de partida.6
  • RT-PCR: Dos procesos: transcripción inversa a partir de ácido ribonucleico (ARN) sintetiza ADN complementario (ADNc), con el cual se realiza posteriormente la(s) PCR(s) correspondiente(s). De esta forma se pueden amplificar genes que estaban expresados en el momento del estudio.7
  • PCR en tiempo real o cuantitativa: El principio de la técnica se basa en la PCR punto final, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la amplificación es diferente. El término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra. El producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción. El sistema garantiza de PCR en tiempo real garantiza una alta sensibilidad, especificidad y eficiencia. Los ingredientes químicos en la PCR en tiempo real, son los mismos utilizados en la PCR punto final, sólo que generalmente la enzima, dNTP’s, Mg +, el buffer y el sistema reportero de fluorescencia para detectar los productos amplificados se venden juntos en una solución conocida como «Master mix», el agua es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas. Los primers deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta especificidad y para que generen amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb; si éstos son más grandes, la eficiencia de la reacción disminuye considerablemente.8
  • PRC de células viables: Como paso previo a la amplificación del fragmento de ADN diana, la muestra se somete a una neutralización del material genético “libre” en la suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este paso inicial, los resultados de la PRC evidenciaron solamente la presencia de células vivas presentes en nuestra muestra.3

 

Diagnóstico por PCR:

Como paso previo a la amplificación del fragmento de ADN diana, la muestra se somete a una neutralización del material genético “libre” en la suspensión, o el procedente de células dañadas o muertas. Con este paso inicial, los resultados de la PRC evidenciaron solamente la presencia de células vivas presentes en nuestra muestra.

Desde que Kary B. Mullis inventara la PCR (reacción en cadena de la polimerasa), a principios de la década de 1980, en el horizonte de este campo ha ido apareciendo una gran cantidad de aplicaciones al diagnóstico clínico. Esta técnica ha tenido tanta influencia en el desarrollo de la biología y, por consiguiente, en la medicina, como el descubrimiento de la estructura de doble hélice del material genético (ADN). El hecho de poder amplificar mínimas cantidades de ADN de manera específica ha propiciado su aplicación en la detección de microorganismos difíciles de cultivar, infecciones virales recientes, siendo clave en la identificación de virus y retrovirus, polimorfismos que causan enfermedades y marcadores de cáncer, entre otras muchas aplicaciones. Hoy por hoy.9

En un principio la PCR sólo era aplicable a la detección de ADN; sin embargo, utilizando un paso previo y con ayuda de las retrotranscriptasas, podemos detectar también ARN (RT-PCR), que es el material genético presente en los llamados retrovirus, como el VIH o la hepatitis C.9

La amplificación de una porción del material genético perteneciente a un microorganismo o a un virus nos informa solamente de la presencia o no de esta infección en el paciente analizado (PCR cualitativa). 9

Sin embargo, si se monitoriza el proceso de amplificación de la secuencia en cuestión a tiempo real, podemos cuantificar la cantidad de material genético que está presente en la muestra (PCR a tiempo real). La Q-PCR en tiempo real nos posibilita no sólo conocer la presencia de la infección sino también cuantificar el número de copias existentes, convirtiéndose en instrumento crucial para la determinación de la carga viral. 9

Por otra parte, la posibilidad de poder amplificar varias secuencias específicas de un mismo espécimen (PCR múltiple) nos aporta una información completa de la presencia de la infección.9

 

Futuras indicaciones:

  • Microbiología: Detección de agentes patógenos, da resultados fiables en un intervalo corto de tiempo (horas), mientras que el método actual, los cultivos, tardan días. En la actualidad se han desarrollado ensayos de PCR para la detección de Listeria, Legionella, Borrelia, Leptospira, Chlamydia, Neisseria y Treponema, entre otros. Además, son cada vez más extendidas la determinación de la resistencia a antibióticos de bacterias aisladas en pacientes y detección de parásitos como Toxoplasma, Trypanosoma y Cryptosporidium.9
  • Cáncer y virus: En el diagnóstico del cáncer la aplicación de la PCR ha sido esencial para determinar la presencia de marcadores específicos del desarrollo de esta enfermedad, así como la aparición de polimorfismos que inducen eventos oncológicos. Un ejemplo claro lo constituyen los niveles de expresión de factores como HER-2 y la tipo IIa, genes importantes en el desarrollo del cáncer de mama, fácilmente detectables por PCR en tiempo real. Sus niveles indican una mala prognosis para el paciente en cuestión. Por otra parte, la localización de mutaciones en genes como el p53 es otra de las aplicaciones de la PCR al diagnóstico en el campo de la oncología.9
  • Virología: Son agentes patógenos con un material genético muy simple, el aislamiento de su ADN o ARN es sencillo y, por último, el diagnóstico por cultivo es difícil y laborioso. En este apartado merecen una especial mención los retrovirus que provocan el sida, ya que la PCR ha contribuido a eliminar el periodo ventana en su detección. No obstante, con la PCR se puede reconocer su presencia transcurridas 48-72 horas de la contaminación, siendo más prudente esperar una semana para eliminar posibles falsos negativos. Por otra parte, la posibilidad que brinda la cuantificación de las copias existentes ayuda en el ajuste del tratamiento.9
  • Enfermedades neurodegenerativas: detección de polimorfismos que sirven para la clasificación de este tipo de enfermedades.9
  • Diagnóstico prenatal: identificar posibles fallos genéticos en los fetos.9

 

CONCLUSIÓN

La PCR es una técnica diagnóstica de creación relativamente reciente, que ha visto un gran protagonismo últimamente por el diagnóstico del SARS-COV-2.

 

Nos ofrece la oportunidad de dar resultados en menos tiempo y más fiables que las técnicas anteriores, como son, por ejemplo, las técnicas diagnósticas en microbiología basados en el crecimiento bacteriano, que puede tardar días, o incluso semanas. En el caso de la virología, podremos detectar el agente causal sin tener que esperar a que el huésped desarrolle anticuerpo, es decir, sin tener que esperar el periodo ventana; y como ya sabemos, el tiempo en medicina, es crucial para el tratamiento y prevención de enfermedades, como hemos vivido últimamente con la pandemia del COVID-19.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). National Human Genome Research Institute. [Internet]. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa
  2. Reacción en cadena de la polimerasa (RCP). National Human Genome Research Institute. [Internet]. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://www.genome.gov/es/about-genomics/fact-sheets/Reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa
  3. Equipo de comunicación Aconsa. Reacción en cadena de la polimerasa: que es la PCR más allá de su uso por la COVID-19. Aconsa. [Internet]. 2020 Mayo 28. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://aconsa-lab.com/reaccion-en-cadena-de-la-polimerasa/
  4. PCR anidada. Analytical Biotech. [Internet]. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://analyticalbiotech.wordpress.com/pcr-anidada/
  5. Hibridación in situ. National Human Genome Research Institute. [Internet]. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Hibridacion-in-situ
  6. Méndez-Álvarez Sebastián, Pérez-Roth Eduardo. La PCR múltiple en microbiología clínica. Elsevier. [Internet]. Marzo 2004. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-la-pcr-multiple-microbiologia-clinica-13058027
  7. Díaz-Alonso Carmen, Garrote-Santana Heidys, Amor-Vigil Ana María, Suárez-González Yandi, González-Mugica Romero Raúl. Cuantificación de ácido ribonucleico para la realización de la técnica de RT- PCR. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter [Internet]. 2013 Sep [citado 2021 Jun 24] ; 29( 3 ): 298-303. Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-02892013000300010&lng=es.
  8. De Dios L Tamay. Ibarra C, Velasquillo C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real. Mediagraphic. [Internet]. Mayo-Agosto 2013. [Citado 2021 Jun 24] Disponible en: https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/52083062/pcr_medic_graphic.pdf?1489036646=&response-content-disposition=inline%3B+filename%3DPcr_medic_graphic.pdf&Expires=1624473929&Signature=hFgeGvOzUyPxim8H8j2ZdF2kVOuAq8X-V5eL0YAI3kNYExwBGxt9n8CXsYVCV6IU8sZeFJ1XFPJ5~BSWmmCQmAJXGlKxQi1o4OB-cOu~rtRzLFAXptVNzzqZFx2v3MYaeNHDHeAHtkDAoyMXHtkGmTGHZfpsBK8-yP9Vr7tBgc8pIG1yZikX4LYjn8dxhacxvesZor8sAH9HrONnpFcGR10OOuML8zD-Delo~FMx0yhxtJ8lmkELu8Ktmm8qU6UJmt71n8PA5eer5QXYJDZefbcdhWDOoyUQqRvkklUa5Laa-b1Bsj0uvZ22fYmvd~j6~tvU~VG0zBkFWoARiQV~Hw__&Key-Pair-Id=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA
  9. Lopez Collazo Eduardo. ¿Qué es la PCR?. Empireo. [Internet] 4 Septiembre 2006. [Citado 2021 Jun 24]. Disponible en: https://www.empireo.es/pcr/