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Diagnóstico de sars-cov-2 por PCR en tiempo real mediante el uso de sonda marcada con una molécula fluorescente y otra apantalladora.

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8 abril 2021

AUTORES

  1. Leticia Ricarte Leris. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.
  2. María López Gómez. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
  3. Raúl Gregorio de la Riva. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Provincial Nuestra Señora de Gracia, Zaragoza.
  4. Irene García Pallás. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa, Zaragoza.
  5. Victoria Millán Lázaro. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
  6. Casandra Martín Fernández. Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.

 

RESUMEN

En diciembre de 2019, en Wuhan, provincia de Hubei, China, se observaron casos de neumonía idiopática. El posterior análisis y la secuenciación de muestras respiratorias dio como resultado un nuevo tipo de coronavirus. Inicialmente nombrado como 2019-nCoV y finalmente como se le conoce actualmente: SARS-CoV-21.

 

PALABRAS CLAVE

Coronavirus, SARS-CoV-2, COVID19, biología molecular, RT-PCR.

 

ABSTRACT

In December 2019, cases of idiopathic pneumonia were observed in Wuhan, Hubei province, China. Analysis and sequencing of respiratory samples resulted in a new type of coronavirus. Initially named as 2019-nCoV and finally as it is currently known: SARS-CoV-21.

 

KEY WORDS

Coronavirus, SARS-CoV-2, COVID19, molecular biology, RT-PCR.

 

INTRODUCCIÓN

Los coronavirus son virus ARN monocatenarios de cadena positiva que poseen envoltura. Se conocen seis especies de coronavirus que causan trastornos respiratorios, digestivos, hepáticos y neurológicos de gravedad variable en el ser humano. Los coronavirus se agrupan en cuatro géneros: Alfacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus y Deltacoronavirus. Los Betacoronavirus han causado gran interés en la comunidad científica y en la salud mundial en los últimos años: el SARS-CoV (severe acute respiratory síndrome coronavirus) y el MERS-CoV (Middle East respiratory síndrome coronavirus).

 

La forma en que pudo transmitirse el virus desde la fuente animal a los humanos es desconocida. Se cree que pudo ser al contacto directo con animales infectados o sus secreciones.

 

Entre las personas, el SARS-CoV-2 puede transmitirse por diferentes vías, siendo la principal el contacto directo y la inhalación de gotas y aerosoles respiratorios emitidos por un enfermo al toser, estornudar o hablar. También por contacto a través de fómites1.

 

Se han observado casos de transmisión de la madre al feto a través de la barrera placentaria.

 

OBJETIVO

El objetivo de esta revisión bibliográfica es poner en conocimiento una de las técnicas de PCR en tiempo real utilizada para el diagnóstico de SARS-CoV-2.

 

METODOLOGÍA

Se ha realizado una revisión bibliográfica de literatura científico sanitaria en bases de datos como Scielo, Elsevier, y MedlinePlus. Como buscador se ha utilizado Google Académico, así como páginas web de organismos oficiales como la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas (SEIMC).

 

RESULTADOS

La PCR en tiempo real se lleva a cabo mediante oligonucleótidos específicos y una sonda marcada con fluorescencia y otra apantalladora (quencher).

 

Los materiales necesarios para realizar la técnica son:

  • -Equipo de PCR en tiempo real (termociclador).
  • -Extractor de RNA.
  • -Kit de extracción de RNA.
  • -Vortex.
  • -Micropipetas de 0,5 a 20 microlitros y de 20 a 200 microlitros.
  • -Puntas con filtro.
  • -Guantes desechables sin polvo.
  • -Batas desechables.
  • -Campana de bioseguridad.

 

Técnica2:

-Extracción de RNA:

El proceso de extracción está basado en partículas magnéticas ubicadas en una punta de pipeta para separar las partículas del líquido.

Primero se produce una lisis celular mediante una proteinasa K. El ARN es absorbido por las partículas magnéticas de superficie hidrofílica mediante un ion caotrópico y alcohol. Dichas partículas magnéticas son recuperadas del tampón y lavadas con un buffer alcohólico, el ARN se eluye con agua caliente a modo de tampón y el eluido es recogido en un tubo para posterior amplificación.

 

-Control positivo:

El control positivo viene en un vial liofilizado, se trata de gran cantidad de copias del molde, por lo que su manipulación y reconstitución debe realizarse separado del resto de componentes y muestras.

La resuspensión se realiza con agua libre de RNAsa/DNAsa y debe mezclarse bien, utilizando un vortex para ello.

Una vez reconstituido se separa en alícuotas para así minimizar las congelaciones/descongelaciones, ya que este control debe conservarse a -20ºC.

 

-Protocolo PCR:

Para cada ensayo que se realiza se debe incluir un control positivo y otro control negativo.

Se reconstituirán tantos pocillos como el número de muestras se van a analizar, incluidos los controles.

1-Se pipetean 15 μL del buffer de rehidratación, en todos los pocillos y en los dos de los controles.

2- Adición de las muestras y controles.

Añadir 5 μL de RNA extraído de cada muestra (eluido obtenido en el paso previo de extracción), y 5 μL de control positivo y negativo en sus correspondientes pocillos. Una vez adicionados los pocillos deben taparse y golpear suavemente sobre una superficie dura, para asegurar que el líquido queda en el fondo de los tubos, también pueden centrifugarse.

3-Configuración del termociclador.

Se colocarán los pocillos en el mismo orden en el que se configuren las muestras en el programa, identificadas por el número de petición de cada paciente.

Debe elegirse el tipo de ensayo que se quiere realizar, en este caso se trata de RNA por lo que se realiza una retrotranscripción.

La retrotranscripción se realiza a 45 grados, mientras que la desnaturalización se lleva a cabo a 95. La etapa de elongación/ hibridación es a 60 grados, y es en este momento cuando se recogen los datos de la fluorescencia por medio de los canales FAM (gen ORF1ab), ROX (gen N) y HEX, JOE o VIC (Control Interno).

 

-Interpretación de los resultados:

El control positivo y el negativo validará cada ensayo; dado que se podrá observar la ausencia de señal en el pocillo del control negativo y la presencia de señal en el pocillo de control positivo.

El control interno verificará la correcta mezcla de amplificación.

En este ensayo se consideran positivas las muestras cuando el CT está por debajo de 38 y en el control interno se produce o no la gráfica de amplificación, no siendo necesaria.

Por el contrario se considerarán negativas las muestras que no se detecte una curva de amplificación por encima de ese umbral, pero el control interno sí que realiza dicha curva.

Las curvas de amplificación deben describir una forma sigmoidea, para su correcta validación.

Si el control negativo realizará una curva de amplificación se invalidará el ensayo, así como cuando el control positivo no presente señal alguna en su pocillo. Se deberá repetir de nuevo todo el ensayo.

Si por el contrario es el control interno el que muestra ausencia de señal en los pocillos, se intentará solucionar repitiendo la amplificación con una dilución 1:10 de la muestra, y si se trata de problemas de inhibición se repetirá de nuevo la extracción del RNA.

En caso de que el resultado sea ambiguo se deberá verificar que la técnica se ha llevado a cabo correctamente en todos los pasos, revisando los parámetros y comprobando que la curva tiene forma sigmoidea, el resultado será validado apoyándose en la historia clínica del paciente y otras pruebas por un facultativo.

 

CONCLUSIÓN

La técnica de elección actualmente para la detección del SARS-CoV-2 sigue siendo la realización de la PCR, se ha demostrado que es la técnica más útil para la detección de ácidos nucleicos (en este caso RNA) del virus, siendo la más sensible y específica un se dispone hasta el momento. La detección de dos genes del virus en el mismo procedimiento acelera la confirmación de un caso como positivo3.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social. https://www.mscbs.gob.es/profesionales/saludPublica/ccayes/alertasActual/nCov/documentos/20200317_ITCoronavirus.pdf
  2. CerTest biotec https://www.certest.es/es/products/sars-cov-2-orf1ab-and-n-genes
  3. Sociedad española de enfermedades infecciosas y microbiología clínica. Recomendaciones intitucionales. https://www.seimc.org/documentos-cientificos/recomendaciones-institucionales