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Detección del género Mycobacterium con tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.

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28 enero 2021

AUTORES

  1. Margarita Elu Escalante. Primer Autor. Técnico Superior En Laboratorio De Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés De Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  2. Noemí Pérez Caamaño. Técnico Superior En Laboratorio De Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés De Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  3. Guillermo Sánchez Barrón. Grado Universitario En Enfermería. Servicio Aragonés De Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  4. Violeta Pedragosa González. Grado Universitario En Enfermería. Servicio Aragonés De Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
  5. Daniel Candala Ramírez. Grado Universitario En Enfermería. Servicio Aragonés De Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
  6. Alba Berrocal Elu. Diplomado Universitario De Enfermería. Servicio Aragonés De Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.

 

RESUMEN

La tinción de Ziehl Neelsen (ZN), es una técnica de coloración diferencial que permite la identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).

Entre los BAAR se encuentran las micobacterias, agentes etiológicos de enfermedades como la tuberculosis (TBC) y la lepra.

Es un método de tinción que permite un diagnóstico rápido y presuntivo de infección por micobacterias. Debemos el nombre de esta tinción al bacteriólogo Franz Ziehl y al patólogo Friedrich Neelsen quienes la desarrollaron en el año 1883. Es un método de tinción que permite un rápido y presuntivo diagnóstico de la infección tuberculosa.

Revisamos las características de esta tinción y su utilidad.

 

PALABRAS CLAVE

Tinción de Ziehl Neelsen, Mycobacterium tuberculosis, tinción diferencial, micobacteria, método simplificado.

 

ABSTRACT

The Ziehl Neelsen (ZN) stain is a differential staining technique that allows the identification of acid-fast bacilli (AFB).

AFB include mycobacteria, etiological agents of diseases such as tuberculosis (TB) and leprosy.

It is a staining method that allows a quick and presumptive diagnosis of micobacterial infection.

We owe the name of this stain to the bacteriologist Franz Ziehl and the pathologist Friedrich Neelsen who developed it in 1883.

We review the characteristics of this stain and its usefulness.

 

KEY WORDS

Ziehl Neelsen staining, Mycobacterium tuberculosis, differential staining, mycobacteria, simplified method.

 

INTRODUCCIÓN

Las micobacterias son un grupo de microorganismos de gran importancia clínica, ya que varias de sus especies son la causa de diversas infecciones humanas tales como la tuberculosis y la lepra con una relevante morbilidad y mortalidad.

No todas las micobacterias son patógenas aunque en determinadas ocasiones pueden comportarse como microorganismos oportunistas en pacientes inmunocomprometidos e incluso inmunocompetentes llegando a producir la enfermedad. Las denominadas micobacterias atípicas o ambientales pueden hallarse en el suelo, el agua, o en productos de animales.1

Actualmente constituyen uno de los problemas sanitarios de mayor gravedad a nivel mundial. Según la OMS cerca de dos millones de personas murieron de tuberculosis en 2015 siendo principal causa de muerte infecciosa en el mundo por encima del VIH y el paludismo.2

 

OBJETIVO

Definir la metodología de la tinción de Ziehl-Neelsen, realizada de forma manual, a partir de muestras clínicas o colonias aisladas en cultivo, en el laboratorio de Microbiología, con el fin de observar de forma directa los bacilos ácido-alcohol resistentes.

Describir en qué consiste la tinción diferencial ZN y a quienes va dirigida.

 

METODOLOGÍA

Se ha realizado una revisión bibliográfica de literatura científico sanitaria en bases de dato como Scielo, Elsevier y MedlinePlus. Como buscador se ha utilizado Google Académico, así como páginas web de organismos oficiales tales como la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas (SEIMC) y la Organización Mundial de la Salud.

Para acotar las búsquedas se han tenido en cuenta los siguientes criterios: acceso a texto completo gratuito y contando como idiomas con el español y el inglés.

 

RESULTADOS

 

FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN ZN:

Las micobacterias pertenecen al orden Actinomycetales, microorganismos que presentan una morfología entre cocoide y bacilar. Dentro de este grupo Mycobacterium tiene más de 100 especies descritas. Son aerobios estrictos, inmóviles, no poseen cápsula ni flagelos y tampoco forman esporas.3

Son bacilos de difícil tinción debido al alto contenido de lípidos complejos (ácidos micólicos) y de ceras que posee su pared celular lo cual las confiere una alta hidrofobicidad frente a los colorantes habituales. Por lo que es necesario utilizar colorantes altamente concentrados, así como la aplicación de calor ya que facilitará su penetración al interior del bacilo.4

Los colorantes más frecuentemente empleados a estos efectos son los de la técnica de Ziehl-Neelsen y se fundamenta en el hecho de que, una vez teñidos los bacilos, su decoloración posterior no es posible.

La baciloscopia va dirigida a pacientes:

– Con contactos con enfermos tuberculosos, tanto para el diagnóstico del paciente en sí, como para cortar la cadena epidemiológica evitando el contacto con personas sanas.

– Con sintomatología clínica y radiológica de TBC.

– Con tratamiento y para quienes después de 4 meses persisten con la baciloscopia positiva, confirmando el fracaso del tratamiento y su posible farmacotresistencia. En 2019, 465.000 personas enfermaron de TBC por tener resistencia a los antibióticos empleados.1, 5

 

MUESTRA:

Primeramente se obtiene una muestra siendo las de origen respiratorio las más representativas como: el esputo, el esputo inducido, el broncoaspirado (BAS), el lavado broncoalveolar (BAL) y el líquido pleural. También trabajaremos con muestras de orina, aspirado gástrico, biopsias, líquidos biológicos, contenido de abscesos, exudados y líquido cefalorraquídeo.

En el Laboratorio de micobacterias el esputo simple o espontáneo es la muestra más frecuentemente examinada. Debe de recogerse por las mañanas en ayunas ya que es cuando tiene una mayor concentración bacilar. Para su estudio se requieren tres muestras de un volumen de entre 5 y 10 ml y han de ser obtenidas en 3 días consecutivos, para aumentar la sensibilidad, ya que la emisión de bacilos puede ser irregular. En el caso de no conseguir una expectoración espontánea el personal de enfermería deberá inducir el esputo mediante percusión manual (clapping) o aplicando nebulizaciones con soluciones salinas.1

En cuanto a las muestras BAS y BAL son obtenidas por técnicas broncoscópicas y realizadas por personal médico cualificado. La técnica consiste en instilar suero salino a través del fibrobroncoscopio hasta el espacio bronquial. Una vez allí se procederá a absorber la muestra. Se deberán recoger al menos 5ml procesándose lo antes posible ya que la lidocaína, anestésico utilizado a éste fin, inhibe el crecimiento de estas bacterias.6

El aspirado gástrico se emplea fundamentalmente en niños que no saben expectorar para detectar los bacilos en el esputo ingerido. Se realizará la toma a primera hora de la mañana, antes de que se inicie el peristaltismo intestinal ya que sino quedarían eliminados los bacilos deglutidos durante la noche. A la llegada al Laboratorio es preciso neutralizar el jugo si no se va a procesar en las siguientes 4 horas. Se añadirá por partes iguales fosfato sódico trifásico para evitar que la acidez gástrica deteriore la bacteria.1

 

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA PARA LA BACILOSCOPIA:

El Técnico Superior de Laboratorio ha de tomar con un asa bacteriológica una porción significativa de la muestra y extenderla en el portaobjetos en forma de círculos para evitar así superposiciones de campos a la hora de visualizarla. Se fijará el material mediante un calentador eléctrico, y se dejará secar al aire entre 15-20 minutos, o bien, se pasará por la llama.

 

TÉCNICA DE LA TINCIÓN ZIEHL NEELSEN:

Recurriremos al uso del calor ya que de este modo el fenol del colorante consigue introducirse en el interior de las micobacterias.

Los pasos a seguir en la tinción ZN son los siguientes: 4

  • Cubrir totalmente la preparación con fucsina fenicada.
  • Flamear el portaobjetos por el reverso de la lámina hasta conseguir emisiones de vapores tres veces, evitando la desecación y su ebullición. Dejar teñir durante 3 minutos.
  • Lavar con abundante agua destilada para arrastrar el colorante y escurrir.
  • Decolorar cubriéndolo con alcohol-clorhídrico (3% de HCL en 96º de alcohol) y dejar actuar 3 minutos.
  • Enjuagar de nuevo y escurrir.
  • Echar sobre la preparación el colorante de contraste, azul de metileno durante 3 minutos.
  • Lavar y dejar secar al aire.

 

LECTURA DE LA PREPARACIÓN:

La lectura se observará en un microscopio de luz visible con un objetivo de inmersión (x100) añadiendo una gota de aceite sobre el frotis.

Los bacilos ácido-alcohol resistentes se teñirán de color rojo siendo una propiedad característica de Mycobacterium. Se observarán bacilos en forma de varilla recta o ligeramente curvados. El resultado positivo de una baciloscopia indica que estamos ante la presencia de micobacterias. Hay que tener en cuenta que otros microorganismos como Nocardia, Gordonia, Rhodococcus, Tsukamurella pueden presentar también una cierta tinción a la muestra por lo que hay que cerciorarse de su identificación. 1

Encontraremos formas irregulares como bacilos arrosariados, rotos o mal teñidos en aquellos pacientes que toman un tratamiento antituberculoso.

 

INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS:1

La siguiente es la escala internacionalmente adoptada para informar los resultados obtenidos a través de la aplicación de la técnica de coloración Ziehl-Neelsen.

Negativo: Cuando no se visualiza ningún bacilo en toda la preparación.

Positivo: Cuando se visualiza uno o más bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).

– De 1 a 2 BAAR/300 campos: resultado dudoso, se solicitará el envío de una nueva muestra.

– De 1 a 9 BAAR/100 campos: se observan escasos BAAR (+).

– De 1 a 9 BAAR/10 campos: se observan BAAR (++).

– De 1 a 9 BAAR por campo: se observan abundantes BAAR (+++).

– > 9 BAAR por campo: se observan muy abundantes BAAR (++++).

 

CONCLUSIÓN

En el año 2019, 10 millones de personas enfermaron de TBC y 1,4 millones fallecieron por ella. Gracias a la detección precoz de la TBC y de su tratamiento, el número de personas afectadas a nivel mundial está disminuyendo.

La OMS tiene como meta para el 2030, dentro de los Objetivos de Desarrollo Sostenible, acabar con esta pandemia mundial.

El tratamiento de TBC ha salvado 63 millones de vidas en estos últimos 20 años perseverando aún importantes deficiencias a la hora de su diagnóstico y del tratamiento. 7

Por ello, desde los laboratorios de Microbiología tanto el técnico de laboratorio como el facultativo tienen una gran responsabilidad frente a la realización de estas técnicas, visualización al microscopio, así como interpretación.

La baciloscopia es una técnica para el diagnóstico y el control de tratamiento de la tuberculosis. Es una técnica simple, económica, rápida y eficiente que señala los casos infecciosos.

El diagnóstico rápido de infección mediante baciloscopia ayuda a acortar la cadena de transmisión y por lo tanto de la enfermedad.

La TBC es curable y prevenible por lo que es importante potenciar las pruebas diagnósticas que reducen el tiempo del resultado.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Alcaide Fernández de Vega F, Esteban Moreno J, González Martín J, Palacios Gutiérrez J.J. Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica; 9ª ed. Micobacterias; 2005.Disponible en: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia9a.pdf

2. Organización Mundial de la Salud Informe Mundial sobre la Tuberculosis; 2020.Disponible: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death

3. Woods GL. Mycobacteria. Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 23rd ed. Elsevier. 2017; 61.

4. Granados Pérez R, Villaverde Peris MC. Microbiología 1ªed. 2003; Tomo I: 235-237

5. Organización Mundial de la Salud Informe Mundial sobre la Tuberculosis; 2020.Disponible en: https://www.who.int/es/news/item/14-10-2020-who-global-tb-progress-at-risk

6. Flandes Aldeyturriaga. El lavado broncoalveolar: un procedimiento sencillo que aporta mucha información. Revista de patología respiratoria. Elsevier. 2011; 14 (2):41-42. Disponible en: https://www.elsevier.es/es-revista-revista-patologia-respiratoria-318-articulo-el-lavado-broncoalveolar-un-procedimiento-X1576989511206784

7. Organización Mundial de la Salud Informe Mundial sobre la Tuberculosis; 2020.Disponible en: https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2020