Detección de pneumocystis jirovecii por PCR a tiempo real.

AUTORES

1. Andrea Espartero González. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
2. Antonio José Villalba Torres. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
3. Evelyn Bernad Serrano. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Royo Villanova Zaragoza. Zaragoza.
4. Laura Belenguer Crespo. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa. Zaragoza.
5. Dafne Evangelina Melendo Villanueva. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.
6. Rosa María Canillo Sánchez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Servicio Aragonés de Salud. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza.

RESUMEN

Una de las causas más comunes de neumonía es causada por un microorganismo fúngico oportunista denominado Pneumocystis jirovecii, capaz de infectar el tracto respiratorio de individuos cuyo sistema inmunitario se ve comprometido, provocándose una neumonía por Pneumocystis (PCP) ^{1, 2}.

Para evitar esa colonización es imprescindible realizar la detección y diagnóstico del microorganismo a través de pruebas de biología molecular que permitan la identificación del patógeno ³.

El diagnóstico de Pneumocystis Jirovecii se realiza en el Laboratorio de Microbiología mediante técnicas de biología molecular, como puede ser su detección mediante PCR tiempo real (real-time PCR), que será realizada por el Técnico Superior de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

PALABRAS CLAVE

Pneumocystis Jirovecii, Real-time PCR, Biología molecular, PCR, Neumonía.

ABSTRACT

One of the most common causes of pneumonia is caused by an opportunistic fungal pathogen called Pneumocystis jirovecii, which infects the respiratory tract of individuals whose immune systems are compromised, causing Pneumocystis pneumonia (PCP) ^{1, 2}.

To avoid this colonization, it is essential to carry out the microorganism detection and diagnosis through molecular biology tests that allow the identification of the pathogen³.

Pneumocystis Jirovecii diagnosis is made in the microbiology laboratory using molecular biology techniques like real-time PCR, which is performed by the laboratory technician.

KEY WORDS

Pneumocystis Jirovecii, Real-time PCR, Molecular biology, PCR, Pneumonia.

INTRODUCCIÓN

La neumonía por Pneumocystis Jirovecii (PCP) es una antroponosis causante de problemas de salud debido a un microorganismo fúngico atípico que infecta exclusivamente el tracto respiratorio de seres humanos y que puede resultar potencialmente mortal ^{1, 5}. Este tipo de neumonía, es especialmente significativo en pacientes con una inmunodeficiencia adquirida o que se encuentren inmunodeprimidos por otras causas (siendo los más relevantes aquellos infectados por VIH); sin embargo, en pacientes cuyo sistema inmune es normal, esta enfermedad pasa como una infección común ².

En pacientes cuyo sistema inmune se encuentra comprometido, esta enfermedad produce un cuadro asociado al sistema respiratorio cuyos síntomas pueden contar con: disnea de esfuerzo progresiva, tos no productiva, fiebre, malestar en el pecho, pérdida de peso y escalofríos ⁴.

Hay varios métodos para la identificación de este hongo como puede ser la observación en fresco de un frotis, una tinción o un análisis molecular; sin embargo, en esta revisión vamos a centrarnos en técnicas de biología molecular, concretamente en la PCR a tiempo real, por ser un método rápido y efectivo pues permite su detección en individuos que meramente están colonizados antes de que presenten síntomas ⁵.

OBJETIVO

Determinar la presencia de Pneumocystis Jirovecii en muestras dentro del laboratorio de Microbiología a partir de una técnica de biología molecular como es la PCR a tiempo real con el fin de ofrecer un diagnóstico rápido, evitando así complicaciones mayores en la salud del paciente.

METODOLOGÍA

Esta revisión bibliográfica se ha llevado a cabo recabando aquella información que se ha considerado relevante en distintas bases de datos como son Scielo, Elsevier y Mediagraphic. Como buscadores de bibliografía se ha utilizado Google Académico y Pubmed lo que ha ofrecido la posibilidad de consultar contenidos de MEDLINE así como una amplia gama de revistas científicas relacionadas con investigaciones biomédicas.

RESULTADOS

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada en el laboratorio para amplificar secuencias de ADN. En términos simples se puede decir que este método usa secuencias cortas de ADN replicándose y permitiendo estudiar la molécula de ADN en detalle dentro del laboratorio de Microbiología. Si bien la PCR sigue siendo una de las técnicas más usadas, lo cierto es que tiene algunas limitaciones como puede ser la dificultad a la hora de cuantificar el producto de la PCR así como el riesgo, siempre presente, de provocar una contaminación dentro del propio laboratorio ⁶.

Con el fin de suplir las desventajas que hay en una PCR convencional se ha desarrollado la PCR a tiempo real (PCR-TR), a la que también se denomina PCR cuantitativa a tiempo real (q-PCR). En esta técnica los procesos de amplificación y cuantificación se realizan simultáneamente en el termociclador sin necesidad de pasos posteriores lo que nos permite acceder a un resultado fiable puesto que permite conocer el número de copias de un determinado gen blanco del microorganismo a buscar (Pneumocystis jirovecii en este caso) por cierta cantidad de volumen de reacción ^1,6,7.

La reacción en cadena de la polimerasa se ha utilizado en microbiología clínica sobre todo en tres campos que son ⁷:

• Diagnóstico etiológico.
• Control de tratamiento con antimicrobianos.
• Caracterización genética de agentes infecciosos.

Es precisamente por esto por lo que la técnica de PCR a tiempo real resulta útil en la detección de Pneumocystis jirovecii de forma eficaz, demostrando ser un método eficaz para microorganismos que no crece en medios habituales y cuya replicación in vitro ha demostrado ser dificultosa.

Las muestras biológicas de elección para realizar una PCR a tiempo real con el fin de determinar la presencia de Pneumocystis Jirovecci serán: Lavado broncoalveolar, esputo (de preferencia inducido), lavado orofaríngeo o material nasofaríngeo ^4,5.

La detección de Pneumocystis Jirovecci a partir de técnicas de biología molecular como es la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real es considerada una técnica de diagnóstico rápido y se basa, como se ha expuesto anteriormente, en la amplificación y detección in vitro de ADN con el fin de determinar la cantidad de genes sintetizados en cada momento de la reacción.

Esta técnica se lleva a cabo según el protocolo del kit usado como puede ser el Viasure® Pneumocystis jirovecii real time PCR Detection kits, diseñado para la detección cualitativa y cuantitativa de este microorganismo. Durante la técnica se usarán oligonucleótidos específicos, así como una sonda marcada con fluorescencia que posteriormente podrá ser monitorizada en equipos de PCR a tiempo real. Del mismo modo, la cuantificación se podrá realizar creando una curva estándar a partir del Pneumocystis jirovecii Quantitative Standard que estará incluido dentro del kit.

La PCR a tiempo real es una valiosa alternativa para determinar Pneumocystis jirovecii en muestras no invasivas debido a su especificidad y rapidez en muestras biológicas cuyas cargas microbiológicas son bajas y que comúnmente no son detectadas por métodos convencionales ¹.

CONCLUSIONES

Debido a que Pneumocystis Jirovecci es un microorganismo que presenta dificultades para crecer en medios de cultivo microbiológicos, hay métodos de diagnóstico para la identificación mediante las tinciones de Papanicolaou modificado, Wright-Giemsa, Gram-Wigert, Gomori-Grocott, Azul de Toulidina, Blanco de calcofúor y Merifluor Pneumocystis cuya elección dependerá de si se busca trofozoítos o quistes ^{1, 4, 8}.

Sin embargo, actualmente, la técnica de elección suele ser la PCR-TR debido a que las muestras biológicas necesarias para su realización resultan no invasivas en contraposición a las muestras necesarias para las tinciones que resultaban generalmente invasivas y molestas para el paciente.

Una de las mayores ventajas de esta técnica, a parte de su fiabilidad en muestras no invasivas, es su capacidad para detectar la presencia o ausencia en de los microorganismos en muestras microbiológicas de pacientes con resultados de microscopía negativos debido a una baja carga viral y que no presentan sintomatología siendo considerados colonizados debido a la ausencia de trofozoítos y quistes ⁹.

A esto hay añadir, que el tiempo empleado para hacer la PCR-TR es considerablemente menor al tiempo necesario en las técnicas tintoriales, lo cual permite que la obtención del diagnóstico se realice con mayor rapidez, quizás la mayor desventaja de esta técnica sea su elevado coste.

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