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Aplicaciones de la PCR. Análisis de infecciones de transmisión sexual (ITS).

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10 junio 2021

AUTORES

  1. Beatriz Gilaberte Angós. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
  2. Sara Borao Pérez. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Clínico Lozano Blesa, Zaragoza.
  3. Esmeralda Álvarez Navarro. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
  4. Patricia Alcalde Rami. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
  5. Eva Melendo Lapuente. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Universitario Miguel Servet, Zaragoza.
  6. Beatriz Forcén Lostao. Técnico Superior en Laboratorio de Diagnóstico Clínico. Hospital Clínico Lozano Blesa, Zaragoza.

 

RESUMEN

Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) o infecciones de transmisión sexual (ITS) son un conjunto de infecciones causadas por patógenos de distinta naturaleza (virus, bacterias, parásitos u hongos) que se transmiten entre personas por vía sexual o contacto físico íntimo.

Para diagnosticar una ITS es posible recurrir a técnicas clásicas como tinción de Gram, examen en fresco, crecimiento en cultivo microbiológico o microscopía de campo oscuro, entre otras. En cambio, en los últimos años se ha comprobado que la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (qPCR) es una técnica realmente útil para estudiar este tipo de infecciones, debido a su alta especificidad para cuantificar el microorganismo de análisis.

La alta sensibilidad del método es otra de las ventajas importantes para tomarlo como elección, ya que permite realizar un cribado eficaz de la población, proporcionando un diagnóstico y posterior tratamiento a los pacientes realmente afectados por alguna de estas infecciones. 1

 

PALABRAS CLAVE

Reacción en cadena de la polimerasa, enfermedades de transmisión sexual, biología molecular, diagnóstico.

 

ABSTRACT

Sexually transmitted diseases (STDs) or sexually transmitted infections (STIs) are a group of infections caused by pathogens of different nature (viruses, bacteria, parasites or fungi) that are transmitted among people by sexual or intimate physical contact.

In order to diagnose an STI, it is possible to resort to classical techniques such as Gram staining, direct examination, growth in culture medium or dark ground microscope, amid others. However, over the last years it has been proven that the real-time polymerase chain reaction (qPCR) is a really useful technique to study this kind of infection, due to its high specificity to quantify the microorganism under analysis.

The high sensitivity of the method is another of the important advantages to take it as a choice, since it allows an effective screening of the population, providing a diagnosis and subsequent treatment to patients really affected by any of these infections.

 

KEY WORDS

Polymerase chain reaction, sexually transmitted diseases, molecular biology, diagnosis.

 

INTRODUCCIÓN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que se fundamenta en la copia y síntesis cíclica de fragmentos de ADN gracias a la acción de una enzima. Partiendo de una muestra inicial escasa, es posible obtener una cantidad suficiente de ADN que pueda emplearse para el estudio posterior.

Durante la división celular que tiene lugar en el organismo, el ácido desoxirribonucleico de la célula inicial se duplica mediante la acción de una enzima, ADN polimerasa, para dar lugar a dos células hijas dotadas de material genético. Con la PCR se simula “in vitro” este proceso de síntesis de ADN realizándose una amplificación de la secuencia de genoma que interese analizar.2 Finalmente, se obtiene un crecimiento exponencial de la región que contiene la información genética útil para el análisis que se desee realizar posteriormente.

Para proceder a la técnica es importante delimitar la zona óptima de amplificación de la cadena de ADN. Para ello se utilizan unos primer o cebadores, cadenas sencillas de 15-30 oligonucleótidos complementarios a la región del ADN diana.1

Cada ciclo reproducido con la PCR consta de tres etapas concretas. En primer lugar, existe una desnaturalización del ADN blanco que se desea amplificar, separando las dos hebras complementarias que conforman la cadena. Posteriormente, los primers se unirán a la secuencia complementaria de la muestra de estudio: fase de apareamiento o annealing. Y, finalmente, tiene lugar la fase de extensión o elongación, en la que la polimerasa va incorporando nuevos nucleótidos a la secuencia iniciada por el primer, de esta forma se va replicando el fragmento de ADN (amplificación).1, 3, 4 Al finalizar las etapas se habrá obtenido una cadena doble de ADN exacto a la inicial.

El proceso completo de una PCR son aproximadamente 35-40 ciclos como este, llevados a cabo en un termociclador y en los cuales se alcanzan elevadas temperaturas de reacción, principalmente en la fase de desnaturalización, en la que se alcanzan los 94-96 ºC.

La duración total del proceso es variable según el número de ciclos y las características del mismo, pueden ser unas 2 horas de duración.

Cada copia resultante de un ciclo es empleada como molde para ciclos posteriores, por tanto, la amplificación se produce de forma exponencial, obteniéndose finalmente millones de copias de un único fragmento inicial. Es posible determinar la cantidad relativa de ADN como 2n-1, siendo n el número de ciclos realizados.3

Existe una variante de la PCR, denominada PCR a tiempo real (qPCR), con la que es posible cuantificar el producto obtenido en cualquier momento de la amplificación, gracias al uso de marcadores fluorescentes (fluoróforos).

El empleo de estas sustancias proporciona una relación entre el producto obtenido en la reacción y el ciclo en el que se ha generado, gracias a la intensidad de fluorescencia originaria, que es detectada posteriormente por un fluorómetro.5 El analizador cuantifica la cantidad de fluorescencia generada en cada ciclo y se va representando, a tiempo real, una gráfica que recoge todos los datos de la reacción.

Si se hace uso de distintas sondas fluorescentes, cada una de ellas específica para un microorganismo concreto, es posible realizar una PCR múltiple analizando al mismo tiempo todos esos patógenos.

Esta técnica presenta una serie de ventajas respecto a la PCR convencional. La mayor de ellas es la opción de obtener información durante toda la reacción, permitiendo la obtención de datos incluso en el momento en que se está realizando.

Es posible que el mayor inconveniente frente a la PCR convencional sea el aumento del coste de los equipos y los reactivos empleados en cada determinación, puesto que las sondas de análisis deben ir marcadas para emitir posteriormente fluorescencia, siendo necesario un equipo capaz de analizar dicha luminiscencia.1

 

OBJETIVO

El objetivo del análisis es detectar patógenos que guardan relación directa con las infecciones de transmisión sexual mediante la técnica de PCR a tiempo real (qPCR). Este proceso se puede llevar a cabo en diferentes tipos de muestras biológicas humanas en función del patógeno del que se tiene sospecha.

La finalidad última del estudio es proporcionar un resultado que, junto con la anamnesis y la historia clínica del paciente, sea información suficiente para elaborar un diagnóstico apropiado.

 

METODOLOGÍA

Para el desarrollo de este documento se han consultado publicaciones de diversas revistas científicas, monografías publicadas on-line, así como libros de texto relacionados con el tema tratado en el artículo.

 

RESULTADOS

A partir de muestras biológicas no invasivas, en el laboratorio de biología molecular se realiza inicialmente una extracción de ADN que, posteriormente, será utilizada en la técnica de PCR para la búsqueda de microorganismos responsables de la patología.

Las muestras obtenidas para el estudio pueden ser diversas, en función del patógeno del que se tenga sospecha. Se suele realizar el análisis en orina, exudado vaginal, rectal, endocervical, faríngeo y uretral. La muestra debe recogerse en un recipiente adecuado para cada caso con un medio de transporte correspondiente, asegurando una conservación óptima hasta que se realice el estudio.6

Desde un punto de vista práctico, se puede realizar la técnica haciendo uso de un kit comercial que se encuentra preparado para analizar determinadas infecciones de transmisión sexual. Actualmente existen en el mercado multitud de paneles de ITS, así como de casas comerciales que proporcionan los elementos y las indicaciones necesarias para realizar un buen diagnóstico en poco tiempo. Por ejemplo, puede emplearse el kit “Seegene® AllplexTM STI Essential Assay”. En él se proporcionan todos los componentes que se deben incluir en la técnica para amplificar las secuencias genómicas que interesan: primer, agua libre de nucleasas y master mix compuesta principalmente por enzimas, buffer y nucleótidos.

En el conjunto también se incluye un control interno, que se dispensará en cada una de las muestras que se analicen, como medida de verificación de la técnica llevada a cabo al observar su curva de amplificación.

El personal de laboratorio procede a la preparación de la placa de amplificación de muestras. En ella se ponen en contacto los extractos de ADN obtenidos directamente de las muestras junto con los componentes necesarios para la síntesis. Este proceso puede realizarse manualmente o puede ser realizado por un autoanalizador. Junto a las muestras, se analiza un control negativo y positivo que se someterán al mismo proceso de estudio para verificar la fiabilidad del examen.

Finalmente, en el termociclador se producen las fases de la PCR. Tienen lugar las tres etapas fundamentales mencionadas con anterioridad en este artículo (desnaturalización, annealing y elongación) de forma cíclica, tantas veces como determine el protocolo de trabajo del laboratorio de análisis, que suele ser en torno a 40 ciclos, con una duración aproximada de dos horas.

Al tratarse de la qPCR, el proceso está monitorizado. Por esta razón, en el software que acompaña el termociclador se puede observar la evolución del análisis en una gráfica a tiempo real en la que se representan los ciclos del proceso (eje de abscisas) y la intensidad de fluorescencia emitida al amplificar fragmentos de ADN de interés existentes en la muestra (eje de ordenadas), información muy destacada para la cuantificación de los mismos.

Las infecciones de transmisión sexual son provocadas por un número muy elevado de patógenos, de diversa naturaleza y poder infectivo. Por ello, en los análisis rutinarios se recurre a estudiar determinados agentes infecciosos de forma simultánea en una misma muestra, es decir, se realiza una PCR múltiple amplificando diferentes fragmentos del mismo extracto de ADN. En el caso del kit mencionado anteriormente, se analiza un panel de siete patógenos causantes de transmisión sexual: Ureaplasma urealyticum, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium Ureaplasma parvum, Chlamydia trachomatis y Trichomonas vaginalis.

El resultado se presenta en una tabla de datos donde aparece la identificación de la muestra analizada, todos los agentes infecciosos estudiados y el resultado de la amplificación en cada uno de ellos: manifestación o no de intensidad luminiscente y, en caso de ser afirmativo, el ciclo en el que se detectó una variación de intensidad respecto a un umbral establecido. Este dato se conoce como Ct.

El número de ciclos es relevante para el diagnóstico de la infección, puesto que, cuanto mayor sea el número de ciclos necesarios para detectar un gen, menor es la cantidad de éste en el extracto que se está analizando. Y, por el contrario, manifestaciones luminiscentes en ciclos más cortos indican que el gen se detectó rápidamente en la muestra, es decir, existe una concentración más elevada de agente patógeno. Esta información puede ser de gran utilidad para conocer el estado de la infección o la respuesta a un tratamiento.

No obstante, es importante considerar y revisar correctamente el resultado de los controles antes de anticiparnos a dar un resultado como válido.

 

CONCLUSIÓN

El descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa supuso una revolución en el campo de la biología molecular siendo, hoy en día, una técnica utilizada diariamente para diagnosticar un gran número de infecciones, las ITS entre ellas, debido a las ventajas que presenta frente a otros sistemas de análisis.

Es un método que presenta alta especificidad y sensibilidad, ya que con poca muestra es posible detectar el patógeno analizado amplificando de forma exponencial.

Los kits comerciales que actualmente existen en el mercado facilitan mucho la realización de la técnica proporcionando, además, versatilidad en el estudio al ofrecer paneles que permiten detectar distintos microorganismos en una misma muestra.

Todas estas ventajas conllevan un análisis rápido, eficaz y fácilmente reproducible de forma diaria en un gran número de muestras, lo que conlleva la obtención de un diagnóstico con el que poder tratar la infección lo más pronto posible.

 

BIBLIOGRAFÍA

  1. Diz Mellado Olga María. Técnicas de biología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. NPunto [revista on-line]. 2020, septiembre 30 [acceso 24 de abril de 2021]; Vol. III (30). Disponible en: https://www.npunto.es/revista/30/tecnicas-de-biologia-molecular-en-el-diagnostico-de-enfermedades-infecciosas
  2. Villalobo Polo Eduardo. ¿Cómo se detecta si un paciente está infectado por coronavirus? The conversation [revista on-line]. 2020, marzo 24 [acceso 24 de abril de 2021]. Disponible en: https://theconversation.com/como-se-detecta-si-un-paciente-esta-infectado-por-coronavirus-134003
  3. Mérida FJ, Moreno EE. Manual para Técnico Superior de Laboratorio Clínico y Biomédico. Madrid: Editorial Médica Panamericana; 2015.
  4. Pedrosa Amado Andrés. Reacción en cadena de la polimerasa. AMC [Internet]. 1999 abril; 3(2). Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-02551999000200011&lng=es
  5. Aguilera Penélope, Ruiz Tachiquín Martha, Graciela Rocha Munive Martha, Pineda Olvea Benjamín, Chánez Cárdenas María Elena. PCR en tiempo real [monografía en línea]. México: INECC. [acceso 22 de abril de 2021]. Disponible en: http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcrtiempo.pdf
  6. Aznar Martín Javier, Antonio Blanco Galán María, Lepe Jiménez José Antonio, Otero Guerra Luis, Vázquez Valdés Fernando. Diagnóstico microbiológico de las infecciones de transmisión sexual y otras infecciones genitales [monografía en línea]. SEIMC; 2007 [acceso 22 de abril de 2021]. Disponible en: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-procedimientomicrobiologia24.pdf